背景阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病,其发病率高,起病隐匿,严重影响老年人健康。临床主要表现为学习记忆障碍、人格行为异常等。AD病因至今未明,发病机制复杂,主要病理特征有Aβ沉积、Tau蛋白磷酸化、神经元丢失等改变;目前尚无有效治疗方法。因此,AD有效治疗方法的发现及其保护机制是当今神经科学研究的热点和难点。目前,对于AD的研究主要集中在减少Aβ的产生以及Tau蛋白的过度磷酸化、减轻神经炎症和神经干细胞移植等。在AD患者脑部,Aβ的大量堆积引起神经细胞损伤,尤其是星型胶质细胞和小胶质细胞被大量激活,激活的胶质细胞一方面通过释放一些神经营养因子、吞噬清除损伤的细胞碎片和感染物质来修复神经元,另一方面释放大量炎性细胞因子加重神经元损伤。自噬参与多种疾病如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等的发生发展过程;现已证实炎症发生发展过程中可干扰自噬,自噬亦可负向调节炎性因子,影响甚至改变炎症的进程与转归。神经干细胞的发现和体外培养成功,为神经退行性疾病的神经功能重建和神经再生提供了新的思路,虽然通过移植外源性神经干细胞能够弥补衰老神经元的功能缺陷,但因移植排斥及伦理学等原因使得其在临床方面的应用受到限制。因此,寻求一种激活内源性神经干细胞并促进其增殖分化,达到重塑神经功能的方法,成为AD近年来研究的热点之一。哺乳动物脑内γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)能神经元占神经元总数的10-15%左右,但GABA能神经元具有重要的生理功能,参与调控整个大脑中主要神经元的活动,如参与学习记忆的形成。有研究表明,激活GABA能神经元能够改善衰老相关的认知功能。因此,本实验拟利用光遗传学技术,特异性激活体内外GABA能神经元,观察AD模型的神经保护作用及其可能的分子生物学机制。目的利用光遗传学技术,特异性激活体内外GABA能神经元,通过神经网络功能的改变对脑内微环境及细胞亚结构的影响,观察其对AD模型的神经保护作用及脑组织中Aβ的代谢过程、炎症反应状态、自噬发生及内源性神经干细胞增殖分化等的影响,探索AD治疗的新方法,并研究其可能的分子生物学机制。第一部分 GABA能神经元激活对AD细胞模型的保护作用及自噬相关蛋白表达的影响方法1.分离、培养新生小鼠原代海马神经元,免疫荧光化学方法测定神经元特异性标志物NSE和GABA能神经元特异性标志物GAD67蛋白表达。2.利用光遗传学技术将慢病毒转染分离培养的原代GABA能神经元,慢病毒包含有GAD67启动子以及光敏感蛋白ChR2和绿色荧光蛋白EGFP。3.利用Aβ1-42损伤慢病毒转染后的小鼠原代GABA能神经元,制备AD细胞模型;光学显微镜下观察细胞形态学变化,MTT法检测Aβ1-42对细胞增殖能力的影响;4.实验分组:正常对照组,模型组(Aβ1-42损伤造模),光刺激组(Aβ1-42+光遗传学刺激),抑制剂组:(Aβ1-42+光遗传学刺激+抑制剂荷包牡丹碱)。5.利用光遗传学技术激活GABA能神经元,光学显微镜下观察光刺激对神经元形态学变化的影响。6.利用ELISA方法检测细胞培养液中LDH释放量的变化;观察GABA能神经元激活对细胞受损情况的影响。7.Western-blot检测GABA能神经元激活对AD模型细胞自噬相关蛋白Beclin1及LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的影响;使用GABA-A受体竞争型抑制剂(荷包牡丹碱)对比光刺激前后自噬相关蛋白表达的变化。结果1.分离培养的原代海马神经元NSE表达阳性,约11%NSE阳性神经元同时表达GABA能神经元特异性标志物GAD67和慢病毒,二者共定位情况良好。2.不同浓度的Aβ1-42对原代海马神经元存活力的影响分别为97.9%,81.1%,69.5%和54.3%,选择抑制效果较强且对细胞损伤性较小的10μM浓度分别作用于神经元12、24、36和48h,不同时间点对细胞存活力的影响分别为99.6%,91.9%,88.1%和60.2%,呈剂量和时间依赖性;选取10μM的Aβ1-42作用48h用于后续实验研究。3.与正常对照组相比,模型组神经元出现形态学损伤性变化;与模型组相比,光刺激组可减轻损伤的发生,抑制剂组形态学损伤无明显改善。4.与正常对照组相比,模型组LDH分泌水平上调(P<0.05);与模型组相比,光刺激组LDH分泌水平出现下调(P<0.05),抑制剂组无变化。5.与正常对照组相比,模型组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达均减少(P<0.01,P<0.05);与模型组相比,光刺激组LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达水平升高(P<0.05),抑制剂组无变化。第二部分 CA1区GABA能神经元激活对AD小鼠神经保护作用及其机制方法1.PCR扩增实验鉴定APP/PS1(+)小鼠。APP/PS1(+)雄性小鼠与C57BL/6 WT雌性小鼠配对繁殖,取出生7d内子代小鼠剪尾鉴定获取APP/PS1(+)雄性小鼠。2.利用立体定向注射技术将含有GAD67启动子以及光敏蛋白ChR2和绿色荧光蛋白EGFP的腺相关病毒转染小鼠海马CA1区GABA能神经元,制备光可控AD动物模型。3.实验分组:选取22-24周龄雄性APP/PS1(-)小鼠12只为一组,同月龄雄性APP/PS1(+)小鼠36只随机分为三组,共四组:正常对照组:APP/PS1(-)小鼠;模型组:APP/PS1(+)小鼠;光刺激组:APP/PS1(+)小鼠+光遗传学刺激;抑制剂组:APP/PS1(+)小鼠+光遗传学刺激+抑制剂荷包牡丹碱。4.小鼠脑冰冻切片及免疫组织荧光化学实验检测GABA能神经元特异性标志物GAD67和腺相关病毒共定位表达情况、海马CA1区GABA能神经元激活对Aβ生成、GFAP和IBA-1表达的影响。5.利用在体多通道电生理技术检测GABA能神经元兴奋时海马CA1区局部场电位Gamma和Theta振荡的变化。6.Morris水迷宫实验和Y迷宫实验相结合用于评估小鼠学习和记忆能力。7.ELISA试剂盒检测海马CA1区GABA能神经元激活对β淀粉样斑块形成的影响。8.Western-blot实验检测海马CA1区GABA能神经元激活对APP淀粉样水解途径产物NTF、CTF以及自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ、神经炎性因子 IL-1β、IL-6、TNF-α和 ERK1/2 表达的影响。9.透射电镜检测海马CA1区GABA能神经元激活对自噬小体形成的影响。结果1.通过PCR鉴定,目的条带约为350bp的小鼠即为APP/PS1(+)小鼠。2.免疫组织荧光化学实验结果显示:小鼠海马CA1区部分神经元同时表达GAD67和腺相关病毒,二者共定位情况良好。3.电生理学结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠海马CA1区Gamma(P<0.01)及Theta振荡功率(P<0.01)均明显降低;与模型组相比,光刺激组可显著提高Gamma、Theta振荡功率(P<0.05),抑制剂组Gamma、Theta振荡功率无变化。4.水迷宫结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期时间在第4、5天延长(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠在第4、5天平均逃避潜伏期时间缩短(P<0.05),抑制剂组无变化。在第6天的空间探索实验中,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠穿越平台次数(P<0.01)、目标象限停留时间百分比(P<0.05)均减少;与模型组相比,光刺激组小鼠穿越平台次数、目标象限停留时间百分比均增加(P<0.05),抑制剂组无变化。Y迷宫实验结果显示,各组小鼠总进臂次数,组间无统计学差异(P>0.05);与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠自发交替正确率减少(P<0.05);与模型组相比,光刺激组小鼠自发交替正确率升高(P<0.05),抑制剂组无变化。5.免疫组织荧光化学实验结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠Aβ1-42表达明显增多(P<0.001);与模型组相比,光刺激组小鼠Aβ1-42表达减少(P<0.01),抑制剂组无变化。6.ELISA试剂盒检测结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达明显增多(P<0.001);与模型组相比,光刺激组小鼠Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达明显减少(P<0.05,P<0.001),抑制剂组无变化。7.Westem-blot结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠CTF和NTF表达增多(P<0.05);与模型组相比,光刺激组小鼠CTF和NTF表达减少(P<0.05),抑制剂组无变化。8.Western-blot结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达明显减少(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠Beclin1和LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达明显增多(P<0.01,P<0.001),抑制剂组无变化。9.透射电镜检测结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠自噬小体明显减少;与模型组相比,光刺激组小鼠自噬小体明显增多,抑制剂组无变化。10.免疫组织荧光化学实验结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠GFAP+和IBA-1+细胞数明显增多(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠GFAP+和IBA-1+细胞数明显减少(P<0.01),抑制剂组无变化。11.Western-blot结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显增多(P<0.01,P<0.05);与模型组相比,光刺激组小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达明显减少(P<0.01,P<0.05),抑制剂组无变化。12.Western-blot结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠p-ERK表达明显增多(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠p-ERK表达减少(P<0.05),抑制剂组无变化。第三部分 DG区GABA能神经元激活通过SDF1/CXCR4通路对AD小鼠内源性神经干细胞增殖分化的影响方法1.PCR扩增实验鉴定APP/PS1(+)小鼠。APP/PS1(+)雄性小鼠与C57BL/6 WT雌性小鼠配对繁殖,取出生7d内子代小鼠剪尾鉴定获取APP/PS1(+)雄性小鼠。2.利用立体定向注射技术将含有GAD67启动子以及光敏蛋白ChR2和绿色荧光蛋白EGFP的腺相关病毒转染小鼠海马DG区GABA能神经元,制备光可控AD动物模型。3.实验分组:选取22-24周龄雄性APP/PS1(-)小鼠12只为一组,同月龄雄性APP/PS1(+)小鼠36只随机分为三组,共四组:正常对照组:APP/PS1(-)小鼠;模型组:APP/PS1(+)小鼠;光刺激组:APP/PS1(+)小鼠+光遗传学刺激;抑制剂组:APP/PS1(+)小鼠+光遗传学刺激+抑制剂荷包牡丹碱。4.小鼠脑冰冻切片及免疫组织荧光化学实验检测GABA能神经元特异性标志物GAD67和腺相关病毒共定位表达情况,以及海马DG区GABA能神经元激活对Nestin和NSE表达的影响。5.利用在体多通道电生理技术检测GABA能神经元兴奋时海马DG区局部场电位Gamma和Theta振荡的变化。6.Morris水迷宫实验和Y迷宫实验相结合用于评估小鼠学习和记忆能力。7.Western-blot实验检测海马DG区GABA能神经元激活对SDF1/CXCR4信号转导通路的影响。结果1.通过PCR鉴定,目的条带约为350bp的小鼠即为APP/PS1(+)小鼠。2.免疫组织荧光化学实验结果显示:小鼠海马DG区部分神经元同时表达GAD67和腺相关病毒,二者共定位情况良好。3.在体多通道电生理结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠Gamma和Theta振荡能量明显降低(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠Gamma和Theta振荡能量升高(P<0.05),抑制剂组无变化。4.水迷宫结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期时间在第4、5天延长(P<0.05);与模型组相比,光刺激组小鼠在第4、5天平均逃避潜伏期时间缩短(P<0.05),抑制剂组无变化。在第6天的空间探索实验中,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠穿越平台次数(P<0.01)、目标象限停留时间百分比(P<0.001)均减少;与模型组相比,光刺激组小鼠穿越平台次数、目标象限停留时间百分比均增加(P<0.05),抑制剂组无变化。Y迷宫实验结果显示,各组小鼠总进臂次数,组间无统计学差异(P>0.05);与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠自发交替正确率减少(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠自发交替正确率升高(P<0.05),抑制剂组无变化。5.免疫组织荧光化学实验结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠Nestin+和NSE+细胞数明显减少(P<0.01);与模型组相比,光刺激组小鼠Nestin+和NSE+细胞数增多(P<0.05,P<0.001),抑制剂组无变化。6.Western-blot结果显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠SDF1和CXCR4的表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,光刺激组小鼠SDF1和CXCR4的表达明显增多(P<0.05,P<0.01),抑制剂组无变化。结论1.利用光遗传学技术激活GABA能神经元,具有保护海马神经元的作用,可能跟诱导细胞自噬发生有关。2.激活海马CA1区GABA能神经元能够改善AD小鼠学习记忆功能,诱导自噬发生,从而促进Aβ降解以及减轻炎症反应,该作用可能和ERK1/2信号通路有关。3.激活海马DG区GABA能神经元能够促进NSC的增殖和分化,改善AD小鼠学习记忆功能,该作用可能和SDF1/CXCR4信号通路有关。