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食管癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全球肿瘤发病率的顺位第八，死亡率占全球肿瘤死亡率的顺位第六。按照病理类型，分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌，ESCC)，后者占食管癌总病例90％以上。ESCC患者普遍伴随着恶病质现象，表现为代谢异常和机体组成改变，以体重进行性减轻为特征。骨骼肌萎缩是恶病质的典型特征之一。目前，缺乏有效的药物缓解这种症状，这主要由于食管鳞癌诱导恶病质骨骼肌萎缩的分子机制不清，另外，缺乏充分验证的动物模型也阻碍了对食管鳞癌骨骼肌萎缩的研究。
细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是细胞主动分泌的微囊泡小体，其包裹功能性蛋白质等物质，可通过与质膜融合并分泌到细胞外，运输至受体细胞，影响后者生理功能。已有研究报道，EVs中的蛋白和miRNAs能够作为肿瘤来源的信号来源因子诱导骨骼肌萎缩，这说明EVs在肿瘤恶病质中扮演关键角色。然而，食管鳞癌分泌的EVs能否运输某些分子到达骨骼肌并诱导其萎缩亟需探究。
根据本课题组前期154例食管鳞癌病例全基因组和全外显子组测序结果分析，我们发现脯氨酰4-羟化酶亚基β(Prolyl 4-hydroxylase subunit beta，P4HB)具有较高的扩增率(9.09％)。另一项表观基因组关联分析报道，P4HB与身体质量指数(Body mass index,BMI)有很强的相关性(1.7×10-16);功能学研究揭示出P4HB能够加速糖基化终产物诱导的平滑肌细胞凋亡。因此，本课题以P4HB为研究对象，针对其在食管鳞癌恶病质骨骼肌萎缩过程中发挥的作用及机制进行研究。主要发现如下:
1.P4HB在食管鳞癌的发生发展中具有重要作用。通过TCGA数据库分析发现，P4HB表达量可以作为食管鳞癌独立的预后评估因素;通过对人食管鳞癌组织芯片进行分析，揭示了P4HB在临床中的重要意义;并且，我们发现P4HB在食管鳞癌细胞系YES2细胞中高表达。
2.恶病质骨骼肌萎缩模型的建立与鉴定。我们利用YES2、KYSE30、KYSE150、KYSE180这4株食管鳞癌细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验，在体内筛选并构建了以YES2细胞系为基础的食管鳞癌恶病质模型。
3.P4HB与恶病质骨骼肌萎缩的相关性研究。通过裸鼠成瘤实验，我们发现高表达P4HB能缩短裸鼠生存期和促进裸鼠出现骨骼肌萎缩现象。接着，我们发现P4HB在食管鳞癌细胞系YES2分泌的EVs中也高表达，并且稳转高表达P4HB的EVs促进小鼠成肌细胞凋亡和抑制其增殖。
4.机制研究方面。我们通过免疫共沉淀实验、质谱实验、westernblot和免疫荧光实验分析发现，P4HB通过调控PHGDH/Bcl-2/caspase-3通路从而诱导成肌细胞凋亡和骨骼肌萎缩，最终诱导食管鳞癌恶病质的发生。
5.药物治疗探索方面。我们利用P4HB的小分子抑制剂(CCF642)进行体外和体内实验，发现其在体外以浓度依赖的方式抑制小鼠和大鼠成肌细胞凋亡，体内实验证明CCF642显著缓解裸鼠体重减轻和骨骼肌萎缩。
综上所述，本课题首次构建了食管鳞癌恶病质体内模型，发现食管鳞癌来源的EVs中的蛋白P4HB能够通过对PHGDH/Bcl-2/caspase-3通路的调控，促进小鼠成肌细胞凋亡，最终诱导骨骼肌萎缩的发生。本研究揭示P4HB具有潜在的治疗食管鳞癌恶病质(骨骼肌萎缩)的价值，并为后续恶病质骨骼肌萎缩的病因学和药物筛选研究提供了宝贵的资源。
细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是细胞主动分泌的微囊泡小体，其包裹功能性蛋白质等物质，可通过与质膜融合并分泌到细胞外，运输至受体细胞，影响后者生理功能。已有研究报道，EVs中的蛋白和miRNAs能够作为肿瘤来源的信号来源因子诱导骨骼肌萎缩，这说明EVs在肿瘤恶病质中扮演关键角色。然而，食管鳞癌分泌的EVs能否运输某些分子到达骨骼肌并诱导其萎缩亟需探究。
根据本课题组前期154例食管鳞癌病例全基因组和全外显子组测序结果分析，我们发现脯氨酰4-羟化酶亚基β(Prolyl 4-hydroxylase subunit beta，P4HB)具有较高的扩增率(9.09％)。另一项表观基因组关联分析报道，P4HB与身体质量指数(Body mass index,BMI)有很强的相关性(1.7×10-16);功能学研究揭示出P4HB能够加速糖基化终产物诱导的平滑肌细胞凋亡。因此，本课题以P4HB为研究对象，针对其在食管鳞癌恶病质骨骼肌萎缩过程中发挥的作用及机制进行研究。主要发现如下:
1.P4HB在食管鳞癌的发生发展中具有重要作用。通过TCGA数据库分析发现，P4HB表达量可以作为食管鳞癌独立的预后评估因素;通过对人食管鳞癌组织芯片进行分析，揭示了P4HB在临床中的重要意义;并且，我们发现P4HB在食管鳞癌细胞系YES2细胞中高表达。
2.恶病质骨骼肌萎缩模型的建立与鉴定。我们利用YES2、KYSE30、KYSE150、KYSE180这4株食管鳞癌细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验，在体内筛选并构建了以YES2细胞系为基础的食管鳞癌恶病质模型。
3.P4HB与恶病质骨骼肌萎缩的相关性研究。通过裸鼠成瘤实验，我们发现高表达P4HB能缩短裸鼠生存期和促进裸鼠出现骨骼肌萎缩现象。接着，我们发现P4HB在食管鳞癌细胞系YES2分泌的EVs中也高表达，并且稳转高表达P4HB的EVs促进小鼠成肌细胞凋亡和抑制其增殖。
4.机制研究方面。我们通过免疫共沉淀实验、质谱实验、westernblot和免疫荧光实验分析发现，P4HB通过调控PHGDH/Bcl-2/caspase-3通路从而诱导成肌细胞凋亡和骨骼肌萎缩，最终诱导食管鳞癌恶病质的发生。
5.药物治疗探索方面。我们利用P4HB的小分子抑制剂(CCF642)进行体外和体内实验，发现其在体外以浓度依赖的方式抑制小鼠和大鼠成肌细胞凋亡，体内实验证明CCF642显著缓解裸鼠体重减轻和骨骼肌萎缩。
综上所述，本课题首次构建了食管鳞癌恶病质体内模型，发现食管鳞癌来源的EVs中的蛋白P4HB能够通过对PHGDH/Bcl-2/caspase-3通路的调控，促进小鼠成肌细胞凋亡，最终诱导骨骼肌萎缩的发生。本研究揭示P4HB具有潜在的治疗食管鳞癌恶病质(骨骼肌萎缩)的价值，并为后续恶病质骨骼肌萎缩的病因学和药物筛选研究提供了宝贵的资源。