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哺乳动物的胎盘是连接胎儿和母体的重要器官,胎盘上含有丰富的血管,确保胎儿生长发育所需的氧和营养物质的供应。以往的研究表明,哺乳动物leptin能够促进血管生成,但也有关于leptin抑制血管生成报道。Leptin对血管生成效应的不一致性是否与剂量有关目前还不清楚。母体血清中leptin水平影响胎儿发育,可能与胎盘血管生成有关。鸡胚尿囊膜是禽类胚胎进行物质交换的场所,其功能类似于哺乳动物的胎盘。将含有leptin的载体放在发育的鸡胚尿囊膜上,血管生成增加。我们的前期研究发现,蛋清和蛋黄内都含有leptin样免疫活性物质,蛋清内注射leptin显著降低鸡胚尿囊膜血管面积和出雏重,并有性别依赖性和品种差异。蛋黄内注射leptin是否影响鸡胚尿囊膜血管生成和胚胎发育还不清楚。目前也没有关于蛋内注射leptin影响鸡胚尿囊膜血管生成机理的相关报道。本试验以生长速度慢的温氏N414土鸡为模型,研究不同剂量leptin对尿囊膜血管生成的影响；通过蛋清和蛋黄内注射重组鼠leptin,研究leptin对尿囊膜血管生成和鸡胚发育的影响,并进一步从体内和体外研究leptin影响尿囊膜血管生成的机理。1leptin对鸡胚尿囊膜血管生成的影响选200枚温氏N414土鸡种蛋进行孵化,7胚龄时开窗,8胚龄时在尿囊膜上放置含有0ng、10ng、100ng、1000ng、5000ng leptin的明胶海绵,48小时后固定尿囊膜,计算血管的数量,研究不同剂量leptin对血管生成的影响。结果显示,10ng、00ng.1000ng、5000ng leptin对尿囊膜大血管和中血管的数量没有影响(P>0.05).10ng leptin显著减少鸡胚尿囊膜小血管的数量(P<0.05),100ng leptin对小血管的数量没有影响(P>0.05),1000ng和5000ng leptin显著增加小血管的数量(P<0.05)。Leptin对小血管数量影响的剂量效应仅表现在雌性,对雄性没有影响。选取温氏N414土鸡种蛋500枚,随机分为五组,蛋清注射组于入孵前在蛋清内注射0μg或0.5μg重组鼠leptin。蛋黄注射组于入孵前在蛋黄内注射0μg、0.5μg或1μg重组鼠leptin。孵化到12胚龄时,在蛋壳上开窗,用甲醇和丙酮混合液固定尿囊膜血管,进行观察、拍照,分析血管的面积和数量,同时称胚重、测量胚长,辨别性别。出雏当天(0日龄)称重。结果显示,蛋清内注射0.5μg leptin显著降低鸡胚尿囊膜血管总面积和小血管的数量(P<0.05),这种抑制效应和胚重及出雏重的降低是一致的(P<0.05)；蛋黄内注射0.5μg leptin对鸡胚尿囊膜血管面积和血管数量没有影响(P>0.05),对胚重和出雏重也没影响(P>0.05)；蛋黄内注射1μg leptin显著降低尿囊膜血管总面积和小血管数量(P<0.05),对胚重和出雏重没有影响(P>0.05)。Leptin对尿囊膜血管生成和胚胎发育的抑制效应仅表现在雌性,对雄性没有影响。以上结果提示,Leptin对鸡胚尿囊膜血管生成的影响与剂量有关,低剂量leptin抑制血管生成,高剂量leptin促进血管生成。蛋清内注射0.5μg leptin显著抑制尿囊膜血管生成和胚胎发育,蛋黄内注射0.5μg leptin对尿囊膜血管生成和鸡胚发育没有影响,蛋黄内注射1μg leptin显著抑制尿囊膜血管的生成,对胚胎发育没有影响。2蛋清和蛋黄内注射leptin影响鸡胚尿囊膜血管生成的机理为了探讨蛋清内注射0.5μg leptin和蛋黄内注射1μg leptin对鸡胚发育造成的不同影响,本试验研究了leptin影响尿囊膜血管生成的分子机理。在前一章的基础上,采集12胚龄鸡胚尿囊膜用于]mRNA表达和蛋白含量检测,采集尿囊液用于一氧化氮(nitric oxide, NO)含量测定。结果显示,蛋清内注射0.5μg leptin显著降低鸡胚尿囊膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA的表达和蛋白含量(P<0.05),显著下调上皮型和诱导型一氧化氮合成酶(endothelial and inducible nitric oxide synthase, eNOS和iNOS) mRNA表达和活性,抑制TNOS活性,从而减少了下游因子尿囊液中NO的含量(P<0.05)。leptin抑制尿囊膜VEGF表达和NO合成仅表现在雌性。尽管蛋清内注射0.5μg leptin对雄性鸡胚尿囊膜VEGF mRNA的表达有降低趋势(P=0.08),但对eNOS和iNOS mRNA表达和活性以及尿囊液中NO的含量没有影响(P>0.05)。蛋清内注射0.5μg leptin对鸡胚尿囊膜碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor2, FGF-2) mRNA表达和蛋白含量(P>0.05)均无显著影响。蛋黄内注射1μg leptin不影响鸡胚尿囊膜VEGF mRNA表达和蛋白含量(P>0.05),也不影响eNOS和iNOS mRNA表达和活性以及尿囊液中NO含量(P>0.05)。蛋黄内注射1μg leptin显著降低雌性鸡胚尿囊膜FGF-2mRNA表达和蛋白含量(P<0.05),对雄性胚没有影响。在哺乳动物,leptin与受体(leptin receptor, LepR)结合后,通过增强下游因子信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)与VEGF启动子的结合,上调VEGF mRNA的表达。尽管蛋清内注射0.5μg leptin对鸡胚尿囊膜LepR mRNA表述和蛋白含量没有影响(P>0.05),但显著降低了雌性鸡胚尿囊膜STAT3mRNA表达(P<0.05),对STAT3蛋白含量有降低趋势(P=0.06)。染色质免疫共沉淀(CHIP)分析结果显示,蛋清内注射0.5μg leptin显著降低雌性鸡胚尿囊膜STAT3与VEGF启动子的结合(P<0.05),从而抑制VEGF基因的表达。以上结果提示：蛋清内注射0.5μg leptin是通过改变STAT3介导的VEGF-NO信号通路来影响尿囊膜血管的生成。蛋黄内注射1μg leptin是通过影响尿囊膜上FGF-2基因表达和蛋白合成来影响尿囊膜血管生成的。3Leptin处理对尿囊膜细胞STAT3介导的VEGF-NO通路的影响本试验培养12胚龄鸡胚尿囊膜细胞,用不同剂量leptin处理细胞,研究leptin对尿囊膜细胞STAT3介导的VEGF-NO信号通路的影响。结果显示,leptin处理24h和48h后,尿囊膜细胞的相对活力显著下降(P<0.05).1ng/mL leptin显著上调尿囊膜细胞LepR mRNA表达和蛋白含量(P<0.05),10ng/mL leptin对LepR mRNA表达和蛋白含量有上调趋势(P=0.058和P=0.063)。1ng/mL和10ng/mL leptin上调尿囊膜细胞STAT3mRNA表达和蛋白合成,促进VEGF mRNA表达和蛋白分泌,同时增加TNOS活性(P=0.07和P=0.06),促进下游因子NO合成(P<0.05)。NO的合成是通过增加eNOS mRNA表达和活性来实现的(P<0.05),leptin处理对iNOS mRNA表达和活性没有影响(P>0.05)。1ng/mL和10ng/mL leptin还显著上调尿囊膜细胞另一血管生长因子FGF2mRNA表达和蛋白分泌(P<0.05)。100ng/mL leptin对尿囊膜细胞LepR和STAT3mRNA表达和蛋白含量无显著影响,不改变VEGF mRNA表达和蛋白分泌,其下游因子eNOS和iNOS mRNA表达和活性以及NO的合成也没有受到影响(P>0.05);100ng/mL leptin对FGF-2mRNA表达和蛋白分泌没有影响。以上结果提示：1ng/mL和10ng/mL leptin激活了尿囊膜细胞STAT3介导的VEGF-NO信号通路；并增加FGF2mRNA表达和蛋白分泌。在体试验和体外试验都证明了leptin通过影响STAT3介导的VEGF-NO信号通路来影响血管生成；也可以通过改变FGF2来影响血管生成。Leptin对血管生成的效应在体外和体内结果正好相反,推测可能与尿囊膜细胞所处的生理状态和leptin剂量有关,也可能由体内其它激素引起。