目的:先天性马蹄内翻足（congenital clubfoot,CCF）是常见的严重危害儿童健康的出生缺陷,CCF肌肉异常表型主要包括:肌无力,肌萎缩,Ⅰ型纤维增加,Z线结构破坏,肌浆网扩张,线粒体肿胀等。目前,CCF的致病机理尚不清楚,但认为是在胚胎发育期间,由遗传因素和环境因素共同作用,致使某些与远端肢体骨骼,神经肌肉等发育有关的基因及其产物异常,而引起CCF的发生。前期我们课题组主要围绕CCF进行了相关研究,发现Fhl1基因是CCF的易感基因。Fhl1基因定位于Xq26,在骨骼肌中高度表达,参与骨骼肌细胞骨架维持、成肌细胞分化、肌力传导以及调节肌纤维大小等功能。为探究Fhl1基因与CCF患者肌肉组织异常的关系,前期我们课题组应用TALENs技术成功制作了Fhl1^-/y小鼠并且通过表型分析发现Fhl1^-/y小鼠具有繁殖能力,且有Z线结构破坏,肌浆网扩张,线粒体肿胀等类CCF症状。因此,Fhl1^-/y小鼠可以作为探讨CCF肌肉表型发生机制适合的动物模型。此外,遗传流行病学调查结果表明孕期吸烟是CCF发生的重要危险环境因素。孕期吸烟,香烟中的有害成分可以跨过胎盘屏障直接引起胎儿异常发育,也可以通过损伤胎盘结构,间接影响胚胎发育。我们推测:孕期烟草烟雾（cigarette smoking,CS）暴露可能加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型。但是Fhl1基因敲除引起骨骼肌类CCF表型的分子机制以及孕期CS暴露加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型的机制,尚不清楚。有文献报道,细胞凋亡和炎症反应与CCF的发病有关。P2RX7属于P2X受体家族,在某些肌病中P2RX7的表达增加且其被用作治疗肌病的靶点。P2RX7可以通过特异性下游信号传导调控细胞自噬,凋亡和焦亡（炎性细胞死亡）。自噬异常参与杜氏肌营养不良（duchenne muscular dystrophy,DMD）患者和DMD小鼠模型（X-chromosome-linked muscular dystrophy,mdx）的肌肉损伤,并且调节自噬可以作为DMD的治疗方法。细胞凋亡在去神经支配引起的骨骼肌萎缩中发挥重要作用。P2RX7通过触发复杂的下游信号传导,激活NLRP3炎症小体,进而促进细胞焦亡的发生。另外,在DMD患者和mdx小鼠的骨骼肌中,NLRP3炎症小体被显著激活。以上研究结果提示:P2RX7介导的自噬,凋亡和焦亡在骨骼肌异常中发挥重要作用。骨骼肌是可塑性器官,维持骨骼肌结构和功能需要有效和精确的代谢调控。蛋白质的合成和降解与维持细胞稳态密切相关,当蛋白质降解超过蛋白质合成时,就会发生骨骼肌萎缩。组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases,HDACs）通过调节蛋白质的合成和降解在骨骼肌萎缩中发挥重要作用。叉形头转录因子的O亚型（the class O of the forkhead transcription factors,FOXOs）是HDACs下游靶蛋白,FOXOs的激活可以抑制蛋白质合成相关蛋白4EBP的表达,促进泛素-蛋白酶体降解相关蛋白TRIM63和自噬-溶酶体降解相关蛋白LC3的表达。HDACs通过激活FOXOs依赖性的（蛋白质合成和降解相关基因）转录调控促进骨骼肌萎缩。以上研究结果提示:P2RX7介导的骨骼肌细胞自噬,凋亡和焦亡以及HDACs调控的蛋白质合成和降解在骨骼肌发育和功能维持中发挥重要作用。但是,它们在Fhl1基因敲除引起的小鼠骨骼肌类CCF表型和CS暴露引起的骨骼肌异常表型中的作用?孕期CS暴露后,有害物质跨过胎盘屏障是否可以通过P2RX7介导的骨骼肌细胞死亡加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型?目前,尚不清楚。因此,本研究首先分别探究遗传因素（Fhl1基因敲除）和环境因素（CS暴露）对成年小鼠骨骼肌表型的影响及P2RX7介导的细胞自噬,凋亡和焦亡以及HDACs调控的蛋白质合成和降解在其中的作用机制。其次,明确P2RX7介导的骨骼肌细胞死亡在孕期CS暴露加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型中的作用。通过本研究揭示遗传因素（Fhl1基因敲除）和孕期环境因素（CS暴露）的交互作用在CCF发病中的作用,为深入理解CCF患者异常肌肉表型的发生机制和探寻孕期预防CCF畸形发生的环境因素、指导优生优育以及探索治疗CCF的潜在靶点提供一定的理论依据。研究方法:第一部分:Fhl1基因敲除引起小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型形成1.使用TALENs技术制作Fhl1^-/y小鼠,并选择2.5月龄的WT型和Fhl1^-/y型小鼠进行后续实验。2.通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）,观察WT型和Fhl1^-/y型小鼠骨骼肌形态结构。3.采用Western Blot或免疫组化染色（immunohistochemistry,IHC）技术在蛋白质水平上检测FHL1,P2RX7,HSP90,自噬（BNIP3,Beclin1,LC3B,P62）,凋亡（Apaf1,Bcl-2,caspase9,cleaved-caspase3）,焦亡（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）,肌纤维再生（PAX7,MYOD,MEF2C,MYH）相关蛋白的表达量以及HDAC1/2,FOXO1,ac-FOXO1,p-FOXO1和蛋白质合成（mTOR,P70,p-P70）和降解（TRIM63,FBXO32）相关蛋白的表达量。4.采用TUNEL染色检测WT型和Fhl1^-/y型小鼠骨骼肌中细胞凋亡水平。5.采用RT-PCR检测WT和Fhl1^-/y小鼠骨骼肌中MYHⅠ,MYHⅡA,MYHⅡX和MYHⅡB的转录水平。第二部分:曲古抑菌素A抑制烟草烟雾暴露引起的小鼠骨骼肌萎缩1.烟草烟雾（cigarette smoking,CS）暴露小鼠模型的建立。将小鼠分成三组:空气暴露组（Control）,CS暴露组和CS暴露+曲古抑菌素A组（CS+trichostatin A,TSA）,每组至少5只小鼠。将Control组小鼠置于限制器中,暴露于空气120min,每天两次,持续40天。CS组小鼠置于限制器中暴露于CS（每天两次,每次6支烟,每支烟暴露20min）,持续40天。对CS+TSA组的小鼠进行CS暴露的同时进行TSA腹腔注射（0.6mg/kg,隔天一次,持续40天）。2.通过HE染色,观察各组小鼠骨骼肌形态结构。3.采用Western Blot或IHC技术在蛋白质水平上检测HDACs,自噬（LC3B,P62）,凋亡（caspase9,cleaved-caspase3）,焦亡（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）相关蛋白的表达量,以及FOXO1,p-FOXO1,FOXO3,p-FOXO3,蛋白质合成（4EBP,p-4EBP,p70,p-P70）,降解（TRIM63,FBXO32,MUL1）,肌纤维分化（MEF2C,MYOD,MYH,PITX1）相关蛋白和细胞骨架蛋白（MYBPC2,LDB3）的表达量。第三部分:孕期烟草烟雾暴露对Fhl1^-/y仔鼠类先天性马蹄内翻足骨骼肌表型的影响及机制1.孕期CS暴露小鼠的模型建立。3月龄的雌性C57BL/6小鼠(Fhl1^+/-)和雄性C57BL/6小鼠（WT）合笼。将孕11天左右的小鼠分为空气暴露组（Control）和烟草烟雾暴露组（CS）。将Control组的孕鼠置于限制器中,暴露于空气80min,每天两次,直至仔鼠出生。CS组孕鼠置于限制器中暴露于CS（每天两次,每次4支烟,每支烟暴露20min）,直至仔鼠出生。选取Control组和CS组（孕期CS暴露9天）仔代中基因型为WT和Fhl1^-/y的雄性仔鼠进行后续实验。2.通过HE染色,观察各组仔鼠骨骼肌形态结构。3.采用Western Blot技术在蛋白质水平上检测P2RX7,焦亡（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）相关蛋白和细胞骨架蛋白（MYBPC2,LDB3）的表达量。结果:第一部分:Fhl1基因敲除引起小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型形成1.与WT型小鼠相比,在Fhl1^-/y小鼠肌肉组织中具有中心核的肌纤维,萎缩性肌纤维和坏死性肌纤维均明显增多。2.P2RX7以及自噬相关蛋白（HSP90,BNIP3,Beclin1,LC3B,P62）,凋亡相关蛋白（Apaf1,Bcl-2,caspase9,cleaved-caspase3）,焦亡相关蛋白（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）在Fhl1^-/y小鼠肌肉组织中表达量显著高于WT小鼠。3.肌纤维再生相关蛋白（PAX7,MYOD,MEF2C,MYH）在Fhl1^-/y小鼠肌肉组织中表达量显著高于WT小鼠。4.HDAC1/2,FOXO1以及蛋白质合成和降解相关蛋白（TRIM63,FBXO32,mTOR,P70,p-P70）在Fhl1^-/y小鼠肌肉组织中表达量显著高于WT小鼠。第二部分:曲古抑菌素A抑制烟草烟雾暴露引起的小鼠骨骼肌萎缩1.与Control组小鼠相比,CS暴露后小鼠骨骼肌湿重显著降低,具有中心核的肌纤维显著增加。2.HDAC1/2以及蛋白质合成和降解相关蛋白（4EBP,p-4EBP,P70,p-P70,TRIM63,FBXO32,MUL1,LC3,P62）在CS暴露后小鼠肌肉组织中表达量显著高于Control组小鼠。3.肌纤维分化相关蛋白（MEF2C,MYOD,MYH,PITX1）和细胞骨架相关蛋白（MYBPC2,LDB3）在CS暴露后小鼠肌肉组织中表达量显著高于Control组小鼠。4.P2RX7,凋亡相关蛋白（caspase9,cleaved-caspase3）和焦亡相关蛋白（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）在CS暴露后小鼠肌肉组织中表达量显著高于Control组小鼠。5.与CS组小鼠相比,在TSA处理后小鼠骨骼肌湿重显著升高,具有中心核的肌纤维显著降低。6.HDAC1/2和泛素化降解相关蛋白（TRIM63,FBXO32,MUL1）在TSA处理后小鼠肌肉组织中表达量显著低于CS组小鼠。7.肌纤维分化相关蛋白（MEF2C,MYOD,MYH,PITX1）和细胞骨架蛋白（MYBPC2,LDB3）在TSA处理后小鼠肌肉组织中表达量显著低于CS组小鼠。8.P2RX7,细胞凋亡相关蛋白（caspase9,cleaved-caspase3）和焦亡相关蛋白（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）在TSA处理后小鼠肌肉组织中表达量显著低于CS组小鼠。第三部分:孕期烟草烟雾暴露对Fhl1^-/y仔鼠类先天性马蹄内翻足骨骼肌表型的影响及机制1.Control-WT组与Control-KO组相比,仔鼠体重无显著差异。CS-WT组与CS-KO组相比,仔鼠体重无显著差异。与Control-WT组相比,CS-WT组仔鼠体重显著降低。与Control-KO组相比,CS-KO组仔鼠体重显著降低。2.P2RX7和细胞焦亡相关蛋白（NLRP3,ASC,cleaved-caspase1,IL-1β）在Control-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-WT组仔鼠,在CS-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于CS-WT组仔鼠,在CS-WT组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-WT组仔鼠,在CS-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-KO组仔鼠。3.细胞骨架蛋白（MYBPC2,LDB3）在Control-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-KO组仔鼠,在CS-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于CS-WT组仔鼠,在CS-WT组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-WT组仔鼠,在CS-KO组仔鼠骨骼肌中表达量显著高于Control-KO组仔鼠。结论:第一部分:Fhl1基因敲除引起小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型形成1.Fhl1基因敲除引起小鼠类CCF肌肉表型。2.P2RX7介导的细胞自噬,凋亡和焦亡异常以及肌纤维再生异常和蛋白质合成与降解异常参与Fhl1基因敲除引起的小鼠类CCF肌肉表型形成。第二部分:曲古抑菌素A抑制烟草烟雾暴露引起的小鼠骨骼肌萎缩1.CS暴露引起骨骼肌萎缩和肌纤维结构异常。2.蛋白质合成和降解异常,肌纤维分化异常,细胞骨架蛋白表达异常以及细胞死亡（凋亡,焦亡）参与CS暴露引起的骨骼肌萎缩和肌纤维结构异常。3.TSA可能通过抑制HDAC1/2进而抑制泛素化降解,肌纤维分化,细胞骨架蛋白,细胞凋亡和细胞焦亡活性,最终缓解CS暴露引起的骨骼肌萎缩和肌纤维结构异常。第三部分:孕期烟草烟雾暴露对Fhl1^-/y仔鼠类先天性马蹄内翻足骨骼肌表型的影响及机制1.孕期CS暴露加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型。2.P2RX7介导的细胞焦亡异常和细胞骨架蛋白（MYBPC2,LDB3）表达异常参与孕期CS暴露加重Fhl1^-/y仔鼠骨骼肌类CCF表型。