研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一组以慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病,是由于机体自身的胰岛素分泌和(或)作用缺陷所导致。国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)报道,2017 全世界大约有 4.25 亿人患有糖尿病,预计到2045年,全球将有高达6.28亿糖尿病患者,糖尿病患者长期的代谢紊乱最终可导致多系统损伤,如视网膜、肾脏、神经系统、心血管等组织器官慢性进行性病变、功能减退及衰竭,从而导致患者致盲、致残,甚至死亡。糖尿病目前已经成为世界性难题。中医药治疗糖尿病历史悠久,糖尿病属于中医消渴病的范畴,相比较于西医单靶标治疗策略,中医药多成分-多靶标的治疗策略显示出一定优势,在糖尿病的治疗中发挥了一定作用。在“辨证论治”理念的指导下,广州中医药大学第一附属医院以熊曼琪教授为核心的团队提出“瘀热互结、气阴两虚”是糖尿病的主要病机,确立了“活血化瘀,益气养阴”的基本治法。结合临床实践,拟出加味桃核承气汤,并对组方不断进行优化,进行拆方和不同配伍研究,最后制成了院内制剂“降糖三黄片”。在前期的研究中,我们已证实降糖三黄片能够改善血糖、血脂、胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能,对糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病胃肠病变等疾病具有治疗作用。然而,降糖三黄片保护胰岛β细胞功能的机制尚未阐明,因此研究降糖三黄片保护胰岛β细胞功能损伤的机制仍具有重要的意义。胰岛β细胞凋亡增加和去分化均是导致胰岛功能衰竭的机制。胰岛β细胞去分化是指成熟的β细胞失去成熟细胞的特征,丧失部分或全部胰岛素分泌能力。近年来研究证实,胰岛β细胞去分化可能较细胞凋亡在T2DM发生过程中更为重要,并且去分化在胰岛β细胞功能损伤的早期就已经发生。胰腺/十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox 1,Pdx-1)是一种转录因子,可以诱导胰岛素(Insulin)、GLUT2、GK、IAPP的表达,这些蛋白都是成熟的胰岛β细胞的特征性基因。MafA基因也同样参与胰岛素的分泌过程,是重要的转录因子和维持胰岛β细胞功能的标志。Fox01可抑制胰岛α细胞向β细胞转化、保护β细胞免受氧化应激损伤、维持β细胞终末分化状态以及抑制胰腺祖细胞分化为β细胞。Fox01可以在细胞核内竞争结合在Pdx-1基因的启动子上游抑制其转录过程。通过免疫组织化学方法检测实验动物胰腺组织Fox01、MafA、Pdx-1和Insulin的表达情况,可以据此推测降糖三黄片是否通过抑制去分化保护胰岛β细胞功能。蛋白质组学是阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。蛋白质芯片是蛋白质组学常用的检测工具。本实验我们采用了蛋白质芯片的方法对SD大鼠的血清进行分析,寻找各组别大鼠的分子差异,对差异蛋白进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析、GO富集分析和KEGG富集分析,以探讨可能的机制。同时,为了保证蛋白质芯片结果的准确性,并对部分差异因子进行elisa验证。分析实验动物血清蛋白质表达的变化,据此探讨胰岛β细胞功能损伤的可能病理机制以及降糖三黄片可能发挥保护作用的机制。目的:1.观察降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠的糖脂代谢的影响2.观察降糖三黄片对高糖高脂饮食致SD大鼠胰岛β细胞功能损伤的保护作用3.探讨降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠胰岛β细胞去分化的影响4.基于蛋白质组学探讨降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠血清细胞因子的影响方法:1.降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠的糖脂代谢的影响将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、降糖三黄片组。对照组予普通饲料喂养,模型组和降糖三黄片组予高糖高脂饲料喂养。同时,降糖三黄片组予675mg/(kg ·d)降糖三黄片灌胃,对照组和模型组予等体积的无菌水灌胃,每日1次,连续180天,所有组别大鼠自由饮水。每日观察大鼠的饮水、饮食活动,每周测量1次体重。在干预第90天时,各组别大鼠经乙醚麻醉后,采用眼眶后静脉丛采血。连续干预第180天,末次给药后,各组别大鼠,按照45mg/kg体重腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉,腹主动脉采血。采血前均禁食不禁水12小时以上,血液离心后得到血清,测量空腹血糖(FBG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TC)水平。大鼠解剖后,检查腹部脂肪堆积情况。2.降糖三黄片对高糖高脂饮食致SD大鼠的胰岛β细胞功能损伤的保护作用测量第90天、180天的空腹血清胰岛素(FINS)。然后根据公式计算各组别大鼠的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛细胞功能指数(HOMA-β)、胰岛素敏感指数(ISI)。3.降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠胰岛β细胞去分化的影响为了探讨降糖三黄片对胰岛细胞去分化的影响,通过免疫组织化学方法检测各组别胰腺组织中Fox01、MafA、Pdx-1和Insulin的表达情况。4.基于蛋白质组学探讨降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠的血清细胞因子的影响采用蛋白质芯片分析各组别大鼠血清的细胞因子的变化,探讨可能涉及差异的细胞因子,并对部分差异蛋白进行elisa验证。对差异蛋白进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析、GO富集分析和KEGG富集分析,探讨可能涉及的信号通路。结果:1.降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠的糖脂代谢的影响从各组别大鼠体重变化趋势来看,各组别大鼠体重都在不断增加。第30天,各组别大鼠体重增加趋势基本一致。从60天开始,模型组大鼠平均体重较对照组有明显的增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组大鼠体重有降低,差异有统计学意义(P<0.05)。同时解剖提示模型组大鼠腹部脂肪较多、腹股沟脂肪堆积,而降糖三黄片组脂肪堆积情况较模型组大鼠有所改善。在第90天时,各组别大鼠糖脂代谢就出现了差异。与对照组相比,模型组FBG升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组FBG降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组TC升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组TC降低,差异无统计学意义(P=0.23)。与对照组相比,模型组TG升高(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组TG降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组HDL-C降低(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组HDL-C升高(P<0.01)。与对照组相比,模型组LDL-C升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组LDL-C降低(P<0.05)。在第180天时,与对照组相比,模型组大鼠FBG升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组大鼠FBG降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组TC升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组TC降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组TG升高(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组TG降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组大鼠HDL-C降低(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组HDL-C升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠LDL-C升高(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组LDL-C降低(P<0.01)。2.降糖三黄片对高糖高脂饮食致SD大鼠的胰岛β细胞功能损伤的保护作用在第90天时,与对照组相比,模型组的FINS分泌降低(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组FINS分泌高于模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组的HOMA-IR升高(P<0.01),与模型组相比,降糖三黄片组HOMA-IR低于模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组的HOMA-β降低(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组的HOMA-β升高(p<0.05)。与对照组相比,模型组的ISI降低(P<0.01),差异有统计学意义;与模型组相比,降糖三黄片组ISI升高(P<0.01),差异有统计学意义。在第180天时,与对照组相比,模型组的FINS分泌增加(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组降低了 FINS的分泌(P<0.05)。与对照组相比,模型组的HOMA-IR增加(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组HOMA-IR降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组的HOMA-β降低(P<0.01);与模型组相比,降糖三黄片组HOMA-β改善(P<0.05)。与对照组相比,模型组的ISI降低(P<0.01),差异有统计学意义;与模型组相比,降糖三黄片组ISI升高(P<0.01),差异有统计学意义。胰腺组织病理检测显示,对照组:2例动物胰腺组织可见少量的胰岛体积增大、细胞团块状增生、胰岛间质纤维组织增生。其余8例动物胰腺组织结构完好、未见异常变化。模型组:9例动物胰腺组织镜下可见大量胰岛体积增大、边界模糊,胰岛细胞增生及间质纤维组织纤维化。其余1例动物胰腺组织结构完好、未见异常变化。降糖三黄片组:10例动物胰腺组织可见部分胰岛体积增大、边界模糊,胰岛细胞增生及间质纤维组织纤维化。从程度上来看,降糖三黄片组大鼠的胰岛体积增大和胰岛细胞增生程度较模型组有改善。3.降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠胰岛β细胞去分化的影响Insulin表达位点位于胞浆,各组胰岛细胞可见弱至中等阳性表达。与对照组相比,模型组有下调趋势(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组有上调趋势(P<0.05)。Pdx-1表达位点位于胞浆或胞核,呈现棕黄色,各组胰岛细胞可见弱至中等阳性表达。对照组相比,模型组有下调趋势(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组有上调趋势(P<0.05)。Fox01表达位点位于胞浆或胞核,呈现棕黄色,所有胰岛细胞胞可见中度至强阳性表达。与对照组相比,对模型组有上调趋势(P<0.05);与模型组相比,降糖三黄片组有下调趋势(P<0.05)。所有胰岛细胞可见MafA蛋白中度至强阳性表达,与对照组相比,模型组有下调趋势(P<0.05)。与模型组相比,降糖三黄片组有上调趋势(P<0.05)。4.基于蛋白质组学探讨降糖三黄片对高糖高脂饮食的SD大鼠的血清细胞因子的影响蛋白质芯片共筛选出14种差异因子,分别为ICAM-1、TIMP-1、CNTF、Activin A、Eotaxin、Galectin-3、Gas 1、IL-13、LIX、Neuropilin-2、TWEAK R、Decorin、Erythropoietin、Galectin-1。其中模型组与降糖三黄片组有差异的有Activin A、Eotaxin、Galectin-3、CNTF这4种蛋白。模型组与对照组有差异的有ICAM-1、TIMP-1、Activin A、Eotaxin、Galectin-3、Gas 1、IL-13、LIX、Neuropilin-2、TWEAK R、Decorin、Erythropoietin、Galectin-1共13种蛋白。对模型组与对照组的差异蛋白进行PPI、GO和KEGG分析。PPI分析提示有10个蛋白靶点有相互作用,其中以TIMP-1居于核心地位。GO富集分析结果提示,主要涉及对脂多糖反应、细菌源分子反应、凋亡信号通路调节、外源性凋亡信号通路、外源性凋亡信号通路调节、钙离子转运调节、淋巴细胞活性调节、白细胞细胞间粘附、细胞对血管内皮生长因子的反应、免疫球蛋白代谢过程等生物学过程;在分子功能方面,主要涉及了受体配体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、细胞外基质集合、层粘连蛋白结合、趋化因子活性、趋化因子受体结合、激素活性、生长因子活性、信号素受体活性;在细胞组分方面,主要集中在细胞外基质、免疫突触。KEGG富集分析提示,模型组与对照组的差异蛋白涉及了细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、哮喘、类风湿性关节炎、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、TGF-β信号通路和HIF-1信号通路等信号通路。为保证蛋白质芯片数据的准确性,我们选取了 Galectin-3、ICAM-1、NRP2、TIMP-1这4种差异蛋白进行了验证,Elisa验证结果与蛋白芯片结果一致。与对照组相比,模型组 Galectin-3(P-0.00)、ICAM-1(P=0.00)、NRP2(P=0.02)、TIMP-1(P=0.00)水平上调,差异有统计学意义。与模型组相比,Galectin-3(P=0.00)、TIMP-1(P=0.00)下调,差异有统计学意义,ICAM-1、NRP2差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:1.高糖高脂饮食可以导致SD大鼠体重增加、糖脂代谢的紊乱、胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能的损伤。2.降糖三黄片可以改善高糖高脂饮食的SD大鼠糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗,减缓体重的增加,减少胰岛β细胞功能损伤。3.降糖三黄片可以上调Insulin的表达,改善胰岛β细胞功能,可能是通过下调胰岛β细胞Fox01表达,上调MafA、Pdx-1的表达,从而抑制胰岛β细胞去分化,保护胰岛β细胞的功能。4.降糖三黄片还可能通过下调高糖高脂饮食的SD大鼠血清中Galectin-3、TIMP-1蛋白表达,改善炎症反应、胰腺纤维化,保护胰岛β细胞功能。