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1目的本研究以常用中药穿心莲和脱水穿心莲内酯为模型药物,对比研究传统中药和中药单体的体内药动学过程,为中药单体及传统中药在基础理论研究及临床用药替代提供参考。本课题是在国家自然基金项目(NO.30701097)研究内容的基础上,对比研究脱水穿心莲内酯与穿心莲的肠吸收特性及体内药动学。考察脱水穿心莲内酯在不同种属血浆中的稳定性,并初步探讨影响血浆稳定性的因素；建立超滤法测定脱水穿心莲内酯血浆蛋白结合率的方法,考察脱水穿心莲内酯在不同种属血浆中的蛋白结合率；采用肠囊外翻法研究脱水穿心莲内酯的肠吸收机理,并对比研究脱水穿心莲内酯和穿心莲在十二指肠、空肠、结肠、盲肠的吸收特性；建立专属、快速、灵敏的LC/MS/MS法,测定血浆中脱水穿心莲内酯,并应用于脱水穿心莲内酯和穿心莲的药动学研究,阐明脱水穿心莲内酯与穿心莲在体内药动学的差异性。2方法与结果2.1穿心莲提取物含量测定建立HPLC-UV同时测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的色谱方法,测定穿心莲提取物中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量,为后期的肠吸收和药动学研究提供参考。采用色谱条件为：流动相：A为乙腈,B为水,梯度洗脱,A相随时间变化为30%(0～3min),30%～55%(3min～10min),55%(10min～16min),55%～30%(16min～20min);流速：1mL·min-1;柱温：室温；检测波长：245nm。穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯分别在0.2473μg·mL-1～19.78μg·mL-1、0.252μg·mL-1～20.16μg·mL-1线性关系良好。穿心莲提取物中穿心莲内酯的含量为16.8%,脱水穿心莲内酯的含量为4.7%。2.2脱水穿心莲内酯血浆蛋白结合研究建立BSA血浆、大鼠血浆、人血浆超滤样品中脱水穿心莲内酯测定方法。采用超滤法测定脱水穿心莲内酯在BSA、大鼠血浆、人血浆三种不同种属血浆中的蛋白结合率。色谱条件为：流动相：甲醇-水=70-30；流速：1mL·min-1;柱温：室温；检测波长：254nm。脱水穿心莲内酯与BSA血浆、正常人血浆、大鼠血浆的蛋白结合率分别为(71.50±1.50)%、(79.91±2.51)%、(82.41±2.05)%,脱水穿心莲内酯与三种血浆属于中等强度结合,且无浓度依赖,但不同种属血浆间蛋白结合程度存在显著性差异。2.3脱水穿心莲内酯血浆稳定性研究建立BSA血浆、大鼠血浆、人血浆中脱水穿心莲内酯的样品处理方法及药物浓度测定的色谱方法。脱水穿心莲内酯在BSA血浆、正常人血浆、大鼠血浆中,在室温(20-℃)、冰融(-4-℃)条件下保存则至少在12小时内保持稳定,在冰冻(-20-C)条件下保存则至少在30d内保持稳定。脱水穿心莲内酯在BSA、正常人血浆、大鼠血浆的稳定性无显著性差异。良好的稳定性可满足脱水穿心莲内酯在大鼠体内的药动学研究。2.4脱水穿心莲内酯及穿心莲肠吸收特性研究采用肠囊外翻法,研究单体脱水穿心莲内酯及穿心莲提取物肠吸收特性。为保证脱水穿心莲内酯组与穿心莲组的整齐可比性,脱水穿心莲内酯组给以单体脱水穿心莲内酯,穿心莲组给以穿心莲提取物,两组所给药物中脱水穿心莲内酯含量相同。脱水穿心莲内酯及穿心莲提取物中脱水穿心莲内酯在十二指肠、空肠、回肠、结肠四个肠段中的吸收均为被动吸收,且各肠段间无显著性差异。在十二指肠、空肠、回肠、结肠四个肠段中,穿心莲提取物中的脱水穿心莲内酯吸收强于脱水穿心莲内酯单体,吸收增快,累计吸收量增大,但无显著性差异(P>0.5)。2.5脱水穿心莲内酯及穿心莲药动学研究建立LC/MS/MS测定大鼠血浆中脱水穿心莲内酯的方法,采用经典血药浓度法,分别口服给以脱水穿心莲内酯单体和穿心莲提取物,两组所给药物中脱水穿心莲内酯含量相同。毛细管眼眦取血,测定血药浓度随时间变化情况,绘制药时曲线,通过winnonlin软件处理数据,拟合最佳房室模型,对比单体脱水穿心莲内酯和穿心莲提取物中脱水穿心莲内酯在大鼠体内药动学异同。LC/MS/MS质谱条件为采用电喷雾离子源负离子模式(ESI-)进行检测,喷雾电压为3500V,加热毛细管温度为320℃C,鞘气和辅助气为N2,鞘气压力30psi,辅助气压力为10psi,碰撞气为氩气：选择反应(SRM)模式检测,离子对m/z为331／303；一级碰撞能量为30ev,二级碰撞能量为25ev。色谱条件为：流动相为：乙腈-水-甲酸=35-65-0.1%,流速为：0.2mL.min-1,柱温箱温度为：30℃,样品室温度：4℃。脱水穿心莲内酯给药组与穿心莲给药组的高、中、低剂量组中脱水穿心莲内酯的含量相同,脱水穿心莲内酯的给药剂量分别为高剂量组：30mg·kg-1、中剂量组15mg·kg-1、低剂量组7.5mg·kg-1,脱水穿心莲内酯给药组高、中、低剂量的Tmax分别为0.40、0.67、0.45h,Cmax分别为55.42、44.56、7.27ng.mL-1,穿心莲给药组高、中、低剂量Tmax分别为0.48、0.31、1.06h,Cmax分别为441.17、135.38、115.71ng·mL-1,脱水穿心莲内酯给药组与穿心莲给药组Tmax无明显差异,表明脱水穿心莲内酯和穿心莲提取物中脱水穿心莲内酯在吸收速率无明显差异。脱水穿心莲内酯给药组的Cmax均小于穿心莲提取物给药组,表明穿心莲提取物中脱水穿心莲内酯较脱水穿心莲内酯给药组更易吸收。脱水穿心莲内酯给药组高、中、低剂量的CL分别为25094.17、8630.30、19464.80mL·hr-1,提取物给药组高、中、低剂量的CL分别为2046.99、28620.08、7186.77mL·hr-1,穿心莲提取物给药组的CL均低于脱水穿心莲内酯给药组,表明脱水穿心莲内酯给药组较穿心莲提取物给药组更易消除,在体内滞留时间较短。脱水穿心莲内酯给药组高、中、低剂量的Vd分别为232974.18、37688.52、57419.00mL,穿心莲提取物给药组高、中、低剂量的Vd分别为26497.19、15705.12、13117.33mL,穿心莲提取物给药组分布容积均小于单体给药组,表明脱水穿心莲内酯给药较穿心莲提取物给药组较难吸收。3结论脱水穿心莲内酯在BSA、人血浆、大鼠血浆中具有良好稳定性,且不同种属间不存在显著差异性。脱水穿心莲内酯与血浆具有中等程度结合,不同种属血浆间具有差异性。脱水穿心莲内酯与穿心莲提取物在十二指肠、回肠、结肠、空肠均属于被动吸收,无特殊吸收窗,穿心莲提取物肠吸收累积量及吸收速率常数优于脱水穿心莲内酯,但两组间无显著性差异。在大鼠体内,穿心莲提取物中脱水穿心莲内酯更易被吸收,消除减慢,在体内滞留时间延长,生物利用度得到提高。脱水穿心莲内酯单体药动学与穿心莲具有差异性,即中药单体与传统中药的药动学过程可能存在差异性,不能用其中一种情况下的药动学特征代替或外推其他情况下的药动学特征。