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环二核苷酸(Cyclic di-nucleotides)是一种广泛存在于细菌中的第二信使分子。越来越多的研究发现它能调节动物机体的多种生理生化过程和参与动物机体的天然免疫应答，可以应用于免疫预防，免疫治疗，也是一种全新的小分子免疫佐剂可应用于人或者动物的临床试验研究中。但当前的研究现状表明，将枯草芽孢杆菌环二核苷酸合成酶、霍乱弧菌环二核苷酸合成酶等分别在大肠杆菌中重组表达，目的蛋白的表达量低，生物学稳定性差，不能满足当前研究需求，环二核苷酸的稳定合成亟需解决。鉴于环二核苷酸的重要功能及其当前体外合成的困境，本试验通过原核表达，高效获得了具有生物活性的大肠杆菌环二核苷酸合成酶。通过优化合成条件，稳定合成了c-di-GMP这种小分子，同时在添加天然底物的情况下也合成了c-di-AMP和cGAMP为后续此类小分子的大量制备和功能研究奠定了基础。
首先，根据实验室合成的大肠杆菌来源的环二核苷酸合成酶基因的核苷酸序列进行分析，设计引物PCR扩增后，电泳分离，纯化到E.coli-Dnc基因线性片段;用T4连接酶连接线性基因片段与表达载体后;连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，涂布平板筛选;挑取单克隆测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-His-E.coli-Dnc，表明载体构建成功。
其次，将鉴定正确的pET-28a-His-E.coli-Dnc菌株扩大培养，通过对诱导表达条件筛选，SDS-PAGE电泳分析，确定获得高可溶性大肠杆菌环二核苷酸合成酶的条件;后续经过Ni-NTA亲和层析得到了大肠杆菌环二核苷酸合成酶粗产物，后续使用Crystaldex-G25色谱柱和Amicon(R)Ultra-10K对目的蛋白进行了脱盐和浓缩，获得了大量纯度达92％的E.coli-Dnc重组蛋白，为后续试验所需的大量蛋白提供了条件。
最后，通过对合成c-di-GMP反应介质、时间、温度、金属离子种类、金属离子浓度等条件的筛选，获得了合成c-di-GMP的最佳条件，同时通过添加天然底物ATP也成功的合成了c-di-AMP，在以ATP和GTP做为反应底物时，反应混合液经UPLC检测，结果表明生成了cGAMP。
综上所述，本试验成功构建了大肠杆菌环二核苷酸合成酶的重组表达载体;筛选诱导表达条件后，通过原核表达获得了大量具有生物活性的E.coli-Dnc;优化合成条件后，稳定合成了c-di-GMP;同时在添加天然底物的情况下也成功合成了c-di-AMP和cGAMP;建立了一种以大肠杆菌环二核苷酸合成酶稳定获得环二核苷酸的试验方法;为后续环二核苷酸的制备以及生物学功能、机制的研究奠定了试验基础。
首先，根据实验室合成的大肠杆菌来源的环二核苷酸合成酶基因的核苷酸序列进行分析，设计引物PCR扩增后，电泳分离，纯化到E.coli-Dnc基因线性片段;用T4连接酶连接线性基因片段与表达载体后;连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，涂布平板筛选;挑取单克隆测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-His-E.coli-Dnc，表明载体构建成功。
其次，将鉴定正确的pET-28a-His-E.coli-Dnc菌株扩大培养，通过对诱导表达条件筛选，SDS-PAGE电泳分析，确定获得高可溶性大肠杆菌环二核苷酸合成酶的条件;后续经过Ni-NTA亲和层析得到了大肠杆菌环二核苷酸合成酶粗产物，后续使用Crystaldex-G25色谱柱和Amicon(R)Ultra-10K对目的蛋白进行了脱盐和浓缩，获得了大量纯度达92％的E.coli-Dnc重组蛋白，为后续试验所需的大量蛋白提供了条件。
最后，通过对合成c-di-GMP反应介质、时间、温度、金属离子种类、金属离子浓度等条件的筛选，获得了合成c-di-GMP的最佳条件，同时通过添加天然底物ATP也成功的合成了c-di-AMP，在以ATP和GTP做为反应底物时，反应混合液经UPLC检测，结果表明生成了cGAMP。
综上所述，本试验成功构建了大肠杆菌环二核苷酸合成酶的重组表达载体;筛选诱导表达条件后，通过原核表达获得了大量具有生物活性的E.coli-Dnc;优化合成条件后，稳定合成了c-di-GMP;同时在添加天然底物的情况下也成功合成了c-di-AMP和cGAMP;建立了一种以大肠杆菌环二核苷酸合成酶稳定获得环二核苷酸的试验方法;为后续环二核苷酸的制备以及生物学功能、机制的研究奠定了试验基础。