第一部分 mTOR介导胰岛β细胞糖毒性凋亡以及1,25(OH)2VD3的保护作用研究　　目的：证实糖毒性诱导胰岛β细胞凋亡；探寻实验性胰岛β细胞糖毒性凋亡的最佳葡萄糖浓度；探讨mTOR信号通路在胰岛β细胞糖毒性凋亡中的作用；证实1,25(OH)2VD3对mTOR介导的胰岛β细胞糖毒性凋亡的干预作用。　　方法：本部分实验分为两个方面内容：　　（1）培养胰岛β细胞株（INS-1细胞），随机分为：①正常葡萄糖浓度组（Normal glucose，NG）：加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L的培养液进行 INS-1细胞培养；②高葡萄糖浓度组10（High glucose， HG10）：加入葡萄糖浓度为10mmol/L的培养液进行INS-1细胞培养；③高葡萄糖浓度组15（High glucose，HG15）：加入葡萄糖浓度为15mmol/L的培养液进行INS-1细胞培养；④高葡萄糖浓度组20（High glucose，HG20）：加入葡萄糖浓度为20mmol/L的培养液进行 INS-1细胞培养；⑤高葡萄糖浓度组25（High glucose，HG25）：加入葡萄糖浓度为25mmol/L的培养液进行INS-1细胞培养；⑥高葡萄糖浓度组30（High glucose，HG30）：加入葡萄糖浓度为30mmol/L的培养液进行INS-1细胞培养；⑦高葡萄糖浓度组35（High glucose，HG35）：葡萄糖浓度为35mmol/L的培养液进行INS-1细胞培养。本实验采用倒置显微镜观察原位培养细胞形态、台盼蓝拒染、MTT、流式细胞仪分析、电镜等方法观察不同浓度葡萄糖对体外培养的 INS-1细胞生长、增殖及凋亡作用的影响，观察了不同浓度葡萄糖对胰岛β细胞凋亡的现象。　　（2）结合实验内容（1）结果中的高糖浓度，培养胰岛β细胞株（INS-1细胞），分组如下：①正常葡萄糖浓度组（NG）：葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养液进行 INS-1细胞培养；②正常葡萄糖浓度+1,25(OH)2VD3组（NG+VD3）：葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）进行INS-1细胞培养；③高葡萄糖浓度组（HG）：分别加入葡萄糖浓度为25mmol/L培养液进行INS-1细胞培养；④高葡萄糖浓度+1,25(OH)2VD3组（HG+ VD3）：葡萄糖浓度为25mmol/L培养液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）进行 INS-1细胞培养；⑤高葡萄糖浓度+雷帕霉素组（HG+Rap）：葡萄糖浓度为25mmol/L培养液加入雷帕霉素（20nM）进行INS-1细胞培养。本实验通过Western blotting检测高糖诱导INS-1细胞凋亡过程中维生素D受体、DDIT4的表达，检测mTOR信号通路上游蛋白TSC1/2、Rheb及下游蛋白p70S6K及其磷酸化表达、mTOR及其磷酸化表达情况，并以mTOR抑制剂雷帕霉素作为干预对照。　　结果：①倒置显微镜下NG组INS-1细胞呈贴壁性生长,细胞形态规则，细胞密度增加。HG10组、HG15组INS-1细胞与NG组比较无明显变化，偶见发亮的细胞悬浮，随时间延长，细胞密度稍有下降。HG20组、HG25组、HG30组、HG35组INS-1细胞与NG组比较细胞变小,发亮细胞悬浮,出现发泡现象，细胞密度明显下降。　　②台盼蓝拒染及MTT实验结果发现，NG组、HG10组在各时间点对INS-1细胞无明显的增殖抑制作用，HG15组在第3天开始对INS-1细胞增殖有抑制作用，与 NG组比较差异具有统计学意义（P<0.05);HG20组、HG25组、HG30组和HG35组对INS-1细胞增殖有抑制作用（P<0.05)，随时间延长，增殖抑制作用越明显（P<0.01)；IC50为HG25组。　　③电镜下可见HG15组、HG20组、HG25组、HG30组和HG35组INS-1细胞在36h后与NG组比较，出现凋亡细胞，可见较多凋亡小体。　　④ AnnexinⅤ-FITC检测HG20组、HG25组、HG30组及HG35组凋亡率分别为10.05％、15.1%、18.22%及22.43%，显著高于NG组凋亡率1.92％（P<0.01）。而 HG30组与 HG35组细胞死亡率分别为21.72%、29.65%，明显高于NG组细胞死亡率2.30%（P<0.01）。　　⑤NG组、NG+VD3组、HG组和HG+VD3组在24h、36h及48h时VDR蛋白表达均未见明显差异（P>0.05）。　　⑥HG组INS-1细胞在24h、36h及48h时DDIT4蛋白表达降低，与 NG组及 NG+VD3组比较差异具有统计学意义（ P<0.01），1,25(OH)2VD3干预后（HG+VD3组），在24h、36h及48h时INS-1细胞DDIT4蛋白表达与HG组比较，增高明显（P<0.01），接近NG组及NG+VD3组表达水平（P>0.05）。　　⑦ HG组 INS-1细胞 TSC1、TSC2蛋白表达降低（P<0.05），1,25(OH)2VD3干预后（HG+VD3组），在24h、36h及48h时INS-1细胞TSC1、TSC2蛋白表达与HG组比较增高明显（P<0.01），接近NG组及NG+VD3组表达水平（P>0.05）。　　⑧HG组INS-1细胞Rheb蛋白表达明显增高，1,25(OH)2VD3干预后（HG+VD3组），在24h、36h及48h时INS-1细胞Rheb蛋白表达与HG组比较明显降低（P<0.01），接近NG组及NG+VD3组表达水平（P>0.05）。　　⑨ HG组在24h、36h及48h时INS-1细胞mTOR蛋白及其磷酸化水平表达与NG组及NG+VD3组比较均增高（P<0.01），mTOR蛋白磷酸化表达增高尤为明显（P<0.01）。1,25(OH)2VD3干预后（HG+VD3组），在24h、36h及48h时INS-1细胞mTOR蛋白表达及其磷酸化水平与HG组比较明显降低（P<0.01），接近NG组及NG+VD3组表达水平（P>0.05）。　　⑩HG组在24h、36h及48h时INS-1细胞p70S6K蛋白及其磷酸化水平表达与NG组及NG+VD3组比较均增高（P<0.01），p70S6K蛋白磷酸化表达增高尤为明显（P<0.01）。1,25(OH)2VD3干预后（HG+VD3组），在24h、36h及48h时INS-1细胞p70S6K蛋白表达及其磷酸化水平与HG组比较明显降低（P<0.01），接近NG组及NG+VD3组表达水平（P>0.05）。　　结论：葡萄糖浓度大于10mmol/L可以诱导胰岛β细胞凋亡，IC50为25mmol/L，葡萄糖浓度达到25mmol/L时，胰岛β细胞凋亡明显，而细胞死亡并不显著，葡萄糖诱导胰岛β细胞凋亡呈时间-浓度依赖性；高糖及高糖联合1,25(OH)2VD3干预对INS-1细胞VDR蛋白表达影响较之正常组无显著差异。高糖降低 INS-1细胞中 DDIT4表达，而1,25(OH)2VD3可以逆转这一作用。高糖降低INS-1细胞中TSC1、TSC2表达，以TSC2表达降低为主，高糖增高INS-1细胞中Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表达，而1,25(OH)2VD3可以逆转这一作用。高糖异常激活mTOR信号通路，而1,25(OH)2VD3通过与VDR结合，增加DDIT4表达，从而增加TSC1/2表达，降低Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表达，干预胰岛β细胞糖毒性凋亡。　　第二部分1,25(OH)2VD3干预mTOR介导的胰岛β细胞糖毒性凋亡途径研究　　目的：研究1,25(OH)2VD3及mTOR抑制剂雷帕霉素干预胰岛β细胞糖毒性凋亡作用；探讨1,25(OH)2VD3干预mTOR信号通路介导的胰岛β细胞糖毒性凋亡途径。　　方法：体外培养胰岛β细胞INS-1，随机化分为：①正常葡萄糖浓度组（NG）：葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养液进行INS-1细胞培养；②正常葡萄糖浓度+1,25(OH)2VD3组（ NG+VD3）：葡萄糖浓度为5.5mmol/L培养液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）进行INS-1细胞培养；③高葡萄糖浓度组（HG）：分别加入葡萄糖浓度为25mmol/L培养液进行INS-1细胞培养；④高葡萄糖浓度+1,25(OH)2VD3组（HG+VD3）：葡萄糖浓度为25mmol/L培养液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）进行INS-1细胞培养；⑤高葡萄糖浓度+雷帕霉素组（HG+Rap）：葡萄糖浓度为25mmol/L培养液加入雷帕霉素（20nM）进行INS-1细胞培养。　　应用倒置显微镜观察、台盼蓝拒染、MTT、流式细胞仪分析和电镜等方法观察1,25(OH)2VD3干预体外培养的INS-1细胞糖毒性凋亡的作用，并以mTOR抑制剂雷帕霉素作为干预对照，通过Western blotting检测凋亡途径Bcl-2相关级联蛋白表达。　　结果：①倒置显微镜下HG组INS-1细胞在24h、36h和48h与NG组比较细胞密度明显下降，漂浮的发亮细胞较多。HG+VD3组、HG+Rap组与NG组和NG+VD3组INS-1细胞形态类似，呈贴壁性生长，不规则形，大小均一，细胞密度增加。　　②台盼蓝拒染结果及MTT实验均发现，HG组抑制INS-1细胞增殖，与NG组比较差异具有统计学意义（P<0.05)，随时间延长，增殖抑制作用越明显（P<0.01)，1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干预后发现细胞增殖得到恢复，与 NG组及 NG+VD3组比较差异无统计学意义（P>0.05)。　　③电镜下HG组与NG组及NG+VD3组比较，细胞体积缩小,核仁减少或消失，出现较多凋亡小体。1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干预后发现凋亡细胞明显减少（P<0.05)。　　④AnnexinⅤ-FITC检测发现HG组与NG组比较凋亡率增高，差异具有统计学意义（P<0.05），随时间延长，凋亡率增高越明显；而HG+VD3组和HG+Rap组凋亡率与HG组比较明显降低（P<0.05），与NG组及NG+VD3组比较无明显改变（P>0.05）。　　⑤ HG组在24h和36h时Bcl-2蛋白表达均较NG组和NG+VD3组降低（P<0.01），在48h时Bcl-2蛋白表达与NG组及NG+VD3组比较无明显差异（P>0.05），但Bcl-2磷酸化蛋白表达在24h、36h及48h与NG组及NG+VD3组比较明显增高（P<0.01）。HG+VD3组和HG+Rap组在上述三个时间点Bcl-2蛋白及其磷酸化蛋白表达与NG组及NG+VD3组比较均无明显差异（P>0.05）。　　⑥HG组在24h和36h时Cleaved-Caspase3蛋白表达均较NG组和NG+VD3组明显增加（P<0.01），在48h时Cleaved-Caspase3蛋白表达与NG组及NG+VD3组比较无明显差异（P>0.05）。HG+VD3组和HG+Rap组在上述三个时间点Cleaved-Caspase3蛋白表达与NG组及NG+VD3组比较均无明显差异（P>0.05）。　　⑦HG组在24h、36h和48h时细胞色素C蛋白表达均较NG组和NG+VD3组明显增加（P<0.01），在36h时增加最为明显。HG+VD3组和 HG+Rap组在上述三个时间点细胞色素 C蛋白表达与 NG组及NG+VD3组比较均无明显差异（P>0.05）。　　结论：高糖明显诱导胰岛β细胞凋亡，而1,25(OH)2VD3和雷帕霉素可以抑制这种凋亡的发生。高糖增加 Bcl-2磷酸化，增加 Cleaved-Caspase3蛋白、细胞色素C表达，从而促进细胞凋亡，1,25(OH)2VD3和雷帕霉素可以增加Bcl-2蛋白表达，降低高糖作用下Bcl-2磷酸化、Cleaved-Caspase3蛋白及细胞色素C表达，从而抑制胰岛β细胞糖毒性凋亡发生。