跨膜蛋白质的膜内水解过程是一个复杂而重要的生物学问题,而γ-分泌酶底物的水解过程则是一个受调节的膜内蛋白质水解过程。研究发现γ-分泌酶底物同多种疾病的发生发展密切相关,如淀粉样前体多肽APP可以影响阿尔茨海默症的发生、发展,而NOTCH则与多种肿瘤的发生、发展过程有关。因此,研究γ-分泌酶调控的膜内蛋白水解过程对膜蛋白的功能至关重要,发现其新型底物以及研究其全局性底物特性可能会丰富对γ-分泌酶功能的认识,并促进对相关疾病机理的认知。本文首先利用生物化学手段对APP-C99跨膜区附近的氨基酸进行分析,发现特定碱性氨基酸结构基序对于γ-分泌酶剪切是必要的。基于此序列,运用生物信息学方法分析获得I型跨膜蛋白中所有的潜在γ-分泌酶底物,其中56个为已知底物,214个未知的底物。采用生物化学和细胞生物学方法,初步鉴定出LRRN1、CD33、ACE2和AXL是γ-分泌酶的新型底物。其中,对AXL的底物剪切特性进行了深入研究,这包括其体外底物验证、肿瘤细胞中的剪切和剪切片段的细胞生物学特性以及该剪切作用在非小细胞肺癌耐药性的功能探究。为了研究AXL作为γ-分泌酶的底物特性,利用过表达AXL并联合药理小分子化合物,初步证实AXL依次按α-和γ-分泌酶方式进行。其次,通过γ-分泌酶催化残基Presenilin缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）证实AXL的剪切依赖于Presenilin-1。进一步用体外AXL重组蛋白的γ-分泌酶纯酶活力测定方法证实γ-分泌酶可以直接剪切AXL。利用AXL特异性抑制剂或配体Gas6处理,以及激酶失活突变体研究实验均证实其磷酸化负调节AXL的剪切,而磷酸化主要影响α-分泌酶对其剪切,这说明AXL的剪切方式并不依赖于激酶区的磷酸化,其非磷酸化形式更易受α-分泌酶剪切。另外,通过药理小分子工具和基因转染α-分泌酶ADAM10和TACE等,证实人源AXL主要受ADAM10剪切。同时,利用生物化学手段分离细胞核质组分以及EGFP荧光示踪方法均说明AXL-ICD能够转位进入细胞核。通过缺失突变或氨基酸的突变发现AXL-ICD进入细胞核依赖于其N端富含碱性氨基酸的类核定位信号。利用萤光素酶报告基因系统,发现AXL-ICD能够在细胞内起到转录抑制作用。这些实验证据表明AXL-ICD的核定位特性可能对细胞或者生物体发挥着重要的调控作用。进一步地,发现在多种类型的肿瘤细胞和肺癌组织中均存在AXL受α-和γ-分泌酶剪切的方式,其剪切产物AXL-ICD仍然能够定位于细胞核中。非小细胞肺癌细胞HCC827中稳定表达AXL产生对erlotinib耐受,并且该细胞模型中存在α-和γ-分泌酶剪切,其产物AXL-ICD能够定位于细胞核。突变AXL上的γ-分泌酶剪切位点,发现其对erlotinib的耐药性反而加强,表明该剪切作用有利于减轻AXL的耐药性。这些结果提示,AXL受分泌酶介导的剪切途径,即α-和γ-分泌酶依次剪切生成AXL-ICD的过程是抵抗耐药性的一种机制。综合上述,本文首先发现了一类具有结构特征的γ-分泌酶底物库并初步鉴定出了底物LRRN1、CD33、ACE2和AXL。其次,发现AXL受α-和γ-分泌酶依次剪切、该剪切不依赖于其磷酸化的剪切特点。再次,发现γ-分泌酶剪切生成的AXL-ICD能够进入细胞核并依赖其N端的类核定位信号,以及具有转录抑制等生物学特性。最后,发现肿瘤细胞中存在分泌酶介导的AXL水解途径,其剪切有助于缓解非小细胞肺癌对EGFR-TKI的耐药性。总之,本文发现了AXL独特的受α-和γ-分泌酶依次剪切的蛋白质水解过程,可为肿瘤耐药性的机制研究以及发展相关治疗提供新机制和基础。