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本文以酶法制备壳寡糖为目标,通过筛选目的菌株、发酵条件和酶性质研究、酶法制备产物纯化分析等一系列过程得到壳寡糖。然后,利用制备得到的壳寡糖进行细胞试验,考察壳寡糖在体外环境下对小鼠骨髓细胞以及造血干/祖细胞(HSC/HPC)的影响,探讨壳寡糖是否具有促进小鼠HSC/HPC增殖、分化的能力。
1.在选择性培养基中筛选得到目的菌株BSF114,对该菌株进行鉴定的过程中采用了分子方法和形态学方法相结合、先分子后形态学的鉴定思路,确保了鉴定结论的可靠性。在分子生物学法鉴定中,选取内转录间隔区1(ITS1)作为扩增对象,经系统进化分析,结果显示该菌为烟曲霉(A.fumigatus)。这一鉴定结果与后续形态学结果一致,这也同时证明ITS1可单独用于对烟曲霉的鉴定。对此菌株的鉴定工作验证了以上思路的可行性并扩充了ITS1区域在真菌分类应用中的例证,为真菌鉴定工作提供一定的参考。
2.通过对菌株BSF114发酵产酶条件和酶性质的研究,得到从发酵到酶解反应整个过程中各主要条件如下:(1)发酵产酶条件液体摇瓶培养基组成为:1%的壳聚糖粉、蛋白胨0.5%、酵母膏0.1%、0.2%K2HPO4、0.1%MgSO4,初始pH5.0,摇瓶培养36小时。(2)酶解反应条件为:50℃,pH4,反应体系中添加0.25%MnC12的激活剂。
3.壳寡糖酶法制备结果显示:酶解反应12小时为最佳酶解时间。在对壳寡糖进行分离纯化的过程中,尝试对壳寡糖粗品应用凝胶SephadexG-25进行分离纯化。试验中采用电导率、还原糖测定相结合的方法,对待分离物中的目的组分进行快速准确的定位,这大大简化了纯化后对壳寡糖的分析工作。经HPLC分析,表明该纯化方法可对壳寡糖进行有效纯化,同时此过程也为壳寡糖后续细胞活性研究提供了材料。
4.试验中运用细胞免疫磁珠分离和流式细胞检测等技术,研究壳寡糖在体外条件下对小鼠骨髓细胞以及造血干/祖细胞的影响。结果表明:壳寡糖在高浓度条件下对小鼠骨髓有明显的促进增殖的作用。用壳寡糖对基质细胞和造血干/祖细胞共培养体系进行刺激,流式分析结果显示,壳寡糖对CD34+细胞具有促进增殖的作用,并具有促进干/祖细胞向巨核细胞分化的作用,但却不能促进干/祖细胞向淋巴祖细胞进行转化。