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目的研究淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum）的抗抑郁作用与γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid,GABA）含量的关系,分析淡豆豉炮制过程中高富集GABA的影响因素,为科学阐释淡豆豉的“除烦”功效和揭示淡豆豉炮制中GABA形成机理奠定基础。方法1、本实验室前期参照2015版《中国药典》已建立规范的淡豆豉炮制工艺,本研究按此炮制工艺制备淡豆豉,获取各炮制不同时间点样本。2、应用慢性温和不可预知性应激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）抑郁模型,研究淡豆豉的抗抑郁作用与GABA含量的关系。（1）GABA含量测定:应用本课题组前期建立的柱前在线衍生高效液相色谱技术（HPLC-OPA）测定淡豆豉炮制过程中不同时间点样本的GABA含量。（2）CUMS抑郁模型制备:100只昆明小鼠（Kunming mice,KM）按体重随机分为空白组、模型组、盐酸氟西汀组、GABA组、黑大豆组、发酵6 d组、再闷6 d、组、再闷15 d高、中、低剂量组。每组10只,雌雄各半。每只单笼饲养。连续28天,按每天1种或2种刺激随机交替建立CUMS抑郁小鼠模型。除空白对照组外,其余各组均采取单笼饲养及以下慢性应激刺激:禁食24 h,禁水24 h,潮湿垫料24 h,夹尾1 min（以小鼠发出哀鸣声为宜）,45℃热水游泳3 min,斜笼24 h,4℃冷水刺激3 min,震荡2 min,通宵照明24 h,共9种刺激每天随机选取一种应激,持续应激28 d,使小鼠无法预知将要给予的应激。具体安排如下:第1、11、20 d为禁水;第2、10、21、28 d夹尾;第3、12、19 d为潮湿垫料;第4、13、24 d为热刺激;第5、15、22 d为禁食;第6、16、23 d为斜笼;第7、14、26 d为冷刺激;第8、18、27 d为通宵照明;第9、17、25 d为震荡。造模同时连续灌胃给药28 d,观察体重、悬尾、强迫游泳、敞箱、糖水偏好等行为学指标的变化。3、淡豆豉炮制过程中影响GABA富集的主次因素初步分析应用相关性分析、多元回归分析等统计学分析方法,分析淡豆豉炮制中pH、温度、水分、蛋白酶（酸、中、碱性）和谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase,GAD）各指标在GABA形成中的主次地位。（1）淡豆豉炮制过程中相关指标的检测:利用pH计、温度计、干燥失重法、福林酚法及Berthelot显色法分别测定淡豆豉炮制过程中pH、温度、水分、蛋白酶和GAD等指标的动态变化,应用柱前在线衍生HPLC-OPA方法测定淡豆豉炮制过程中GABA的动态变化。（2）统计学方法分析:以淡豆豉炮制过程中各个指标含量为横坐标,以相应时间点样本的GABA含量为纵坐标作散点图,并进行相关性分析和线性回归分析。用Pearson相关系数分别对各指标与GABA含量的相关性进行评价,用双尾检验法评价显著水平。用R2对线性回归模型进行评价,F检验法评价其回归方程的显著性。在此基础上建立多元回归方程,通过比较各因素系数绝对值的大小,明确各指标在GABA形成中的主次地位。4、淡豆豉炮制中产GABA微生物的产GAD能力分析根据淡豆豉炮制过程中影响GABA形成的主要因素,研究各优势微生物在不同pH和温度下产GAD的能力。结果1、按本实验室前期建立的淡豆豉炮制工艺制备淡豆豉,获得以下不同时间点样本:黑大豆（H）、“黄衣上遍”阶段为发酵0、3、6 d（分别记为F0、F3、F6）“再闷”阶段为再闷3、6、9、12、15 d（分别记为Z3、Z6、Z9、Z12、Z15）,成品性状:表面黑色,皱缩不平,质柔软,断面棕黑色,气浓郁,味微甘。样品性状和各项理化指标均符合2015版《中国药典》要求。2、淡豆豉的抗抑郁作用及其与GABA含量的关系（1）各药物组中GABA含量:按前期建立的发酵炮制工艺获取淡豆豉炮制不同时间点样品,并测定样品煎煮液中GABA含量,此次运用柱前在线衍生色谱技术在黑大豆和发酵6 d中未检测出GABA,再闷6 d和再闷15 d的GABA含量分别为5.559 mg/g、8.421 mg/g。（2）淡豆豉抗抑郁作用与GABA的关系:采用单笼饲养加慢性温和不可预知性应激复制抑郁模型,连续给药28 d后,各行为学指标变化如下:与空白组比较,模型组的体重、糖水偏好、跨格数和直立数均减少（p<0.01）;悬尾及游泳不动时间增加（p<0.05）;表明CUMS抑郁模型建造成功。与模型组比较,体重:造模前各组均无差异（p>0.05）,造模后盐酸氟西汀组、GABA组、再闷6 d组、再闷15 d高、中剂量均增加（p<0.05）,黑大豆组、发酵6 d组及再闷15 d低剂量组无差异（p>0.05）;糖水偏好:造模前各组间无差异（p>0.05）,造模后阳性药组、GABA组、再闷6 d组（p<0.01）及再闷15 d高、中剂量（p<0.05）均增加,黑大豆组、发酵6 d组及再闷15 d低剂量组均无差异（p>0.05）;敞箱实验:造模前各组的跨格数、直立数均无差异（p>0.05）,造模后阳性药组、GABA组、再闷6 d组、再闷15 d高、中剂量跨格数增多（p<0.01）,黑大豆组、发酵6 d组及再闷15 d低剂量组均无差异（p>0.05）;阳性药组、GABA组（p<0.01）、再闷15 d高剂量组（p<0.05）的直立数增加,黑大豆组、发酵6 d组、再闷6 d组及再闷15 d中、低剂量组均无差异（p>0.05）。悬尾实验:阳性药组、GABA组、再闷6 d组及再闷15 d高、中剂量组不动时间均减少（p<0.01）,黑大豆组、发酵6 d组及再闷15 d低剂量组均无差异（p>0.05）。强迫游泳实验:各组游泳不动时间均缩短（p<0.01）。3、淡豆豉炮制过程中影响GABA富集的主次因素（1）淡豆豉炮制过程中各指标的动态变化:（1）GABA含量:在炮制前原料黑大豆中含有微量GABA,进入“黄衣上遍”阶段未检测出GABA,洗去黄衣进入“再闷”阶段后,GABA含量逐渐增加,至再闷15 d后含量稳定。（2）pH值:淡豆豉炮制过程中pH值总体处于偏弱酸性呈现先增后减的趋势。（3）温度:炮制体系的温度呈逐渐下降的趋势,在“黄衣上遍”初始阶段温度最高。（4）水分:水分在“黄衣上遍”阶段逐渐降低,进入再闷阶段后逐渐增加后趋于稳定。（5）蛋白酶:淡豆豉炮制过程中酸、中、碱性蛋白酶均呈现先减后增再减的趋势,酸性、中性蛋白酶及碱性蛋白酶最高分别达11.88 U/g、116.56 U/g和69.20 U/g。（6）GAD:GAD活性总体呈现先减后增,于再闷15 d时活性高达17.64 U/g。（2）淡豆豉炮制中GABA富集的主次因素:淡豆豉炮制过程中水分和酸性蛋白酶与GABA相关性系数分别为0.211和-0.340,p值分别为0.324和0.228,相关性较小且无统计学差异;比较回归系数绝对值的大小可知,其它各指标在GABA形成中的主次地位为pH（-0.375）>温度（-0.284）>GAD（0.140）>碱性蛋白酶（0.047）>中性蛋白酶（-0.030）,其中pH、温度和中性蛋白酶与GABA具有负相关性,GAD活力和碱性蛋白酶与GABA存在正相关性。4、淡豆豉炮制中产GABA微生物的产GAD能力:枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Xd3和鸟肠球菌（Enterococcus avium）15R3在pH=6.0、温度为34℃时产GAD活力最高,此时GAD酶活分别达19.43 U/h和11.18 U/h;屎肠球菌（Enterococcus faecium）15r1在pH为5、温度为31℃时产GAD能力最高,酶活达3.41 U/h;极细支孢霉（Cladosporium cladosporioides）ME4在pH为4、温度为28℃时产GAD较强,酶活为11.50 U/h;黄曲霉（Aspergillus flavus）MB2和桔青霉（Penicillium citrinum）ME3均是在pH为7、温度为28℃时产GAD能力最高,酶活分别为41.97、3.44 U/h;黑曲霉（Aspergillus niger）JD2在pH为7、温度为31℃时最适产GAD,酶活为25.78 U/h;溜曲霉（Aspergillus tamarii）MA3在pH为8、温度为28℃时最适产GAD,酶活为12.49 U/h;白腐菌（Phanerochaete sordida）MG1在pH为6、温度为25℃时最适产GAD,酶活达15.74 U/h。结论1.本实验按前期建立的淡豆豉炮制工艺制备淡豆豉其成品性状和各项理化指标均符合2015版《中国药典》要求。2.本研究首次运用经典的CUMS抑郁模型来评价淡豆豉的除烦作用,结果表明淡豆豉对模型小鼠的抑郁行为有较好改善作用,抗抑郁作用与样本的GABA含量有关,为后期进一步明确淡豆豉除烦功效的物质基础提供依据。3.淡豆豉炮制过程中pH、温度、GAD、中性及碱性蛋白酶等指标对GABA的形成有重要的影响,其主次顺序为pH>温度>GAD>碱性蛋白酶>中性蛋白酶。4.淡豆豉炮制过程中各优势菌种最适产GAD的条件也不尽相同,各菌株最适产GAD的条件与淡豆豉自然炮制条件范围相吻合,为进一步阐明淡豆豉炮制过程中GABA动态变化的机制奠定基础。