本研究拟从以下四个方面展开对BRD4在肝癌中的表达和生物学意义进行研究，并探讨BRD4小分子抑制剂JQ1或与其他小分子化合物联合应用诱导肝癌细胞凋亡的机制。以期阐明BRD4对肝癌细胞调控的分子机制，为制定合理的肝癌靶向治疗方法、避免毒副作用奠定基础。　　第一部分:BRD4在肝癌中的表达及其意义。　　第二部分:小分子BRD4抑制剂JQ1的抗肝癌作用及其分子机制的研究。　　第三部分:Mcl-1表达上调抑制了JQ1介导的抗肝癌作用。　　第四部分:冬凌草甲素通过线粒体途径协同增强JQ1诱导的肝癌细胞凋亡。　　第一部分 BRD4在肝癌中的表达及其意义　　目的：　　研究BRD4在肝癌细胞中的表达，及其在肝癌细胞增殖中的作用。研究BRD4在临床肝癌组织、邻近非肿瘤肝组织和正常肝组织中的表达，结合临床、病理资料等，进一步探讨BRD4的临床意义。　　方法：　　培养Hep3B、HCCLM3、HuH7、HepG2、SMMC7721、BEL7402和MHCC97H等7种人HCC细胞系及正常肝细胞LO2，应用western blotting研究BRD4在HCC和LO2细胞中的表达;应用siRNA敲低BRD4在肝癌细胞中的表达，并检测对肝癌细胞增殖的影响。收集72名HCC患者的肿瘤组织及其相应的邻近非肿瘤肝组织，三个正常的人肝组织用作对照。采用组织芯片、免疫组织化学、western blotting和台盼蓝染色试验等方法，检测肝癌组织、邻近非肿瘤肝组织及正常肝组织中BRD4的表达水平，并结合临床病例资料进行统计学分析，研究BRD4在肝癌中的表达及临床意义。　　结果：　　1.BRD4在HCC细胞中高表达。　　2.siRNA转染敲低BRD4显著抑制HCC细胞的增殖。　　3.BRD4在HCC组织中高表达。　　4.BRD4在肝癌组织中表达的临床意义。　　结论：　　1.BRD4在肝癌细胞中高表达，显著促进了肝癌细胞的增殖。　　2.BRD4在肿瘤组织中的表达水平显著高于邻近非肿瘤肝组织，与肝癌的AJCC分期和血管侵犯正相关。　　第二部分 小分子BRD4抑制剂JQ1的抗肝癌作用及其分子机制的研究　　目的：　　通过前期对BRD4在临床肝癌组织、邻近非肿瘤肝组织、正常肝组织和肝癌细胞系中的表达及其临床意义的研究，进一步探讨小分子BRD4抑制剂JQ1的抗肝癌活性及其作用的分子机制，以阐明通过抑制BRD4是否可以有效的诱导肝癌发生凋亡。　　方法：　　Hep3B、HCCLM3、HuH7、HepG2、SMMC7721、BEL7402和MHCC97H等7株HCC细胞系用于该项研究。分别采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)技术、siRNA转染技术、CCK8实验、克隆形成试验、原代培养技术、染色质免疫共沉淀(ChIP)、流式细胞术、western blotting、裸鼠体内荷瘤实验和二代转录组测序技术等方法，观察小分子BRD4抑制剂JQ1的抗肝癌活性。　　结果：　　1.小分子BRD4抑制剂JQ1可以抑制人HCC细胞的增殖。　　2.JQ1可以诱导HCC细胞周期停滞和凋亡。　　3.线粒体凋亡途径介导了JQ1诱导的HCC细胞凋亡。　　4.JQ1抑制了HCC细胞中cMyc的表达。　　5.在HCC细胞系中，抑制cMyc后促进了JQ1介导的抗癌活性。　　6.BIM表达上调在JQ1诱导的HCC细胞凋亡中起到重要的促进作用。　　7.JQ1抑制HCC小鼠移植瘤模型的肿瘤生长。　　结论：　　1.小分子抑制剂JQ1靶向BRD4可以抑制肝癌细胞的增殖，并诱导肝癌细胞发生凋亡。　　2.JQ1主要是通过抑制cMyc、上调Bim的表达，诱导了肝癌细胞的凋亡。　　第三部分 Mcl-1表达上调抑制了JQ1介导的抗肝癌作用　　目的：　　通过前期对BRD4蛋白小分子抑制剂JQ1在HCC中的研究结果分析，我们发现JQ1处理HCC细胞后Bcl-2家族抗凋亡成员Mcl-1表达上调，Mcl-1可能是HCC对JQ1产生抗性的关键分子。本部分实验将进一步探讨JQ1对HCC中Mcl-1表达的影响，并研究这种上调是否对HCC细胞中JQ1介导的抗癌活性产生了负面影响。　　方法：　　HCCLM3、BEL7402、MHCC-97H、HepG2和Huh7等HCC细胞系用于本研究，通过RNA-Seq、siRNA转染技术、流式细胞术检测凋亡、台盼蓝试验、qRT-PCR和western blotting分析等方法，分析JQ1处理HCCLM3和BEL7402细胞系后Mcl-1的表达情况，并在mRNA和蛋白质水平上通过qRT-PCR和western blotting分析进一步验证，通过RNA干扰敲低Mcl-1探讨HCC细胞的凋亡情况，并初步探讨JQ1与其他小分子化合物联合应用的抗癌作用。　　结果：　　1.JQ1诱导HCC细胞中Mcl-1在mRNA水平上表达上调。　　2.JQ1诱导HCC细胞中Mcl-1在蛋白质水平上表达上调。　　3.敲低Mcl-1可以增强JQ1介导的HCC细胞凋亡。　　4.Flavopiridol通过抑制Mcl-1增强了JQ1触发的细胞凋亡信号传导和HCC细胞中的细胞死亡诱导。　　结论：　　1.Mcl-1表达上调抑制了小分子BRD4抑制剂JQ1介导的抗肝癌作用。　　2.抑制Mcl-1可以增强HCC细胞中JQ1触发的细胞凋亡。　　3.JQ1与Mcl-1抑制剂的联合应用有助于肝癌的治疗，为肝癌的联合治疗提供了研究基础。　　第四部分 冬凌草甲素通过线粒体途径协同增强JQ1诱导的肝癌细胞凋亡　　目的：　　许多实体肿瘤对BRD4蛋白抑制剂具有内在的抵抗性，我们前期研究也发现HCC细胞对小分子BRD4抑制剂JQ1具有一定的抗性，为了探索提高BRD4蛋白抑制剂JQ1治疗HCC的新方法，我们研究了JQ1与冬凌草甲素(Oridonin)在肝癌细胞中的联合作用。　　方法：　　HCCLM3、BEL7402、MHCC97H和SMMC7721等HCC细胞系用于本研究，通过CCK8测定、流式细胞术、台盼蓝实验、细胞分级分离和western blotting分析等方法，探讨冬凌草甲素联合JQ1诱导肝癌细胞凋亡的作用及机制。　　结果：　　1.冬凌草甲素抑制HCC细胞中Bcl-2、Mcl-1和xIAP的表达。　　2.Oridonin增强了JQ1介导的肝癌细胞凋亡。　　3.冬凌草甲素增强了HCC细胞中JQ1触发的凋亡信号传导。　　4.线粒体凋亡途径介导了Oridonin和JQ1诱导的HCC细胞凋亡。　　5.冬凌草甲素和JQ1协同抑制了HCC细胞的细胞活力。我们单独应用Oridonin、JQ1或二者组合处理HCC细胞，CCK8检测结果显示单独应用JQ1或Oridonin呈剂量依赖性地抑制细胞活力，并且在HCCLM3细胞系中的IC50值分别为1.8μM和4.2μM;但是，Oridonin和JQ1二者组合的IC50值为0.17μM，与单独使用JQ1或Oridonin的IC50值相比，分别降低了10.6和24.7倍。同样，Oridonin和JQ1二者组合在BEL7402、SMMC7721和MHCC-97H细胞系中也具有很强的活性。对于HCCLM3、MHCC-97H、BEL7402和SMMC7721细胞系，它们的联合指数分别为0.09、0.39、0.46和0.54μM。这些结果表明Oridonin和JQ1在这四种HCC细胞系中均具有一定的协同作用。　　结论：　　1.Oridonin可以提高HCC细胞对小分子BRD4抑制剂JQ1的敏感性。　　2.Oridonin通过线粒体途径协同增强了JQ1对HCC细胞的凋亡作用。