葛根为豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根,性凉,味甘、辛,归脾、胃经,具有发表解肌、升阳透疹的功效,其主要成分是黄酮类物质,总量可达12%,由葛根素、黄豆苷及黄豆苷元等组成,葛根黄酮具有扩张冠状动脉和脑血管、改善微循环、抗氧化、清除自由基和抗缺血性脑损伤等作用。临床上葛根黄酮制剂主要用于心脑血管疾病的治疗。目前对葛根黄酮的研究大多集中在葛根素和大豆苷两种主要的活性化合物上,对其他活性化合物及葛根总黄酮的药效物质基础的研究仍有待进一步加强。本研究从药代动力学和药效动力学角度研究了葛根黄酮的脑神经活性作用物质基础及其作用机制,并探讨了葛根黄酮提高桑白皮活性的降糖机制,主要研究内容和结果如下：第一部分：葛根黄酮的体内药代动力学和药效动力学研究1建立生物样品中5个葛根黄酮化合物的UFLC-MS/MS检测方法首次建立高效、灵敏、稳定可靠地UFLC-MS/MS分析方法,测定5个葛根黄酮化合物,葛根素(PU)、大豆苷元(DA)、3’-甲氧基葛根素(MPU)、3’-羟基葛根素(HPU)以及大豆苷元-8-c-芹菜糖基葡萄糖苷(DAC)在大鼠血浆及脑微透析液中的浓度。分析选用Thermo Syncronis C18柱,流动相为乙腈和水(含0.2%的甲酸)。方法学验证结果显示,该方法具有良好的线性。PU、MPU、HPU、DA、DAC在血浆中的最低检测限分别为5.00、1.00、5.00、10.00、10.00 ng/mL,最低定量限分别为1.00、0.50、2.00、5.00、2.00 ng/mL,在人工脑脊液中的最低检测限分别为2.00、0.50、1.00、5.00和5.00 ng/mL,最低定量限为5.00、1.00、2.00、10.00和10.00 ng/mLo该方法同时呈现出了良好的精密度(RSD<13.87%)和准确度(Bia<12.45%),血浆样品提取回收率在75%-101%范围内,均能满足生物样品测定要求。2葛根黄酮在大鼠血浆及脑脊液中的药代动力学特性研究首次结合微透析技术与UFLC-MS/MS检测方法,研究葛根总黄酮(RPIF)静脉给药后5个黄酮化合物在大鼠脑脊液及血浆中的药代动力学行为特征,评价其血-脑脊液透过特性。结果显示,静脉给予RPIF (80 mg/kg)后,PU、MPU、DA、 DAC以及HPU在血浆中的C0分别为6.53、13.72、1.54、15.84和86.07 μg/mL,其AUC0-t分别为7.30、6.47、0.66、8.39以及32.18 μg·h/mL, PU、MPU、DA DAC四个化合物能进入大鼠脑脊液中,并在0.5-0.8 h内达到血药浓度峰值(Cmax),分别为521.52、415.00、74.34和380.03 ng/mL, AUC0-t分别为0.70、0.55、0.10以及0.35μg·h/mL。5个化合物在血浆与脑脊液中的半衰期t1/2均在1h以内,给药后3-4 h基本检测不到,表明葛根黄酮化合物在体内迅速消除。PU、MPU、DA和DAC的血脑屏障透过率为9.58%、8.50%、15.15%和4.17%,脑脊液透析液中未检测到HPU。推测PU、MPU可能是葛根总黄酮产生脑保护作用的主要活性物质。3葛根黄酮在脑鼠纹状体中的药物代谢动力学与药效动力学研究首次结合微透析技术与UFLC-MS/MS检测方法,研究5个葛根黄酮化合物在纹状体组织中的药代动力学行为及其对纹状体细胞外液中多巴胺(DOA)、谷氨酸(Glu)、5-羟色胺(5-HT)、高香草醛酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、乙酰胆碱(Ach)以及γ-氨基丁酸(GABA) 7种神经递质水平的影响,进一步从药代动力学和药效动力学的角度研究其脑神经活性的作用机制。结果显示,大鼠静脉给予RPIF后(80 mg/kg), PU、HPU、DAC和MPU在大鼠纹状体中的Cmax分别为2.19、1.30、1.02和0.65μg/ml, AUC0-t为2.14、1.40、1.11和1.02μg·h/ml。PU、 HPU和DAC的半衰期t1/2均在0.3 h左右,MPU的t1/2为1.2 h。增大RPIF给药剂量后(160 mg/kg), PU、MPU、HPU、DAC的Cmax分别升高一倍左右,AUC0-t也相应增大。DA在纹状体透析液中的含量极低,无法进行定量分析。对纹状体中神经递质浓度检测结果显示,在80 mg/kg剂量下,静脉给予RPIF可降低正常大鼠纹状体中的DOA和其代谢产物HVA水平,DOA的浓度由81 ng/mL,最低降至45ng/mL, HVA的浓度由2320 ng/mL下降至1810 ng/mL左右。观测GLu浓度,未发现显著性变化。GABA的基础水平为154 ng/mL,在给药后1.5h一过性降低,随后升高至197 ng/mL,然后又呈现下降趋势。5-HT浓度未发现明显变化,其代谢产物5-HIAA的浓度降低,在给药后2h由529 ng/mL下降至331ng/mL。Ach在纹状体中的基础水平为32 ng/mL,给药后无明显变化。在160 mg/kg剂量下,静脉给予RPIF对纹状体中DOA水平没有影响,但可升高HVA水平。在该剂量下,RPIF可显著降低纹状体中GLu的水平,给药后2 h GLu含量由1558ng/mL降至最低,为301 ng/mL,而对GABA水平无影响。给药后5-HT含量无明显变化,其代谢物5-HIAA水平升高。Ach水平呈现波动性升高。由此可见在低剂量和高剂量时,RPIF对神经递质含量变化的作用不尽相同。本部分研究结果揭示了RPIF的主要成分PU、MPU、DA、DAC和HPU在大鼠血浆、脑脊液和纹状体中的药代动力学特性和血脑屏障透过特性,及其对纹状体细胞外液中神经递质水平的影响,为其脑神经活性机制的研究提供了实验依据。第二部分：葛根黄酮增强桑白皮降糖活性的机制研究1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)是桑白皮降糖活性的主要有效成分,通过在肠道内抑制α-酸性葡萄糖苷酶活性而发挥降低餐后血糖作用。葛根黄酮可显著增强桑白皮提取物(富含DNJ)的降糖活性,为了解和揭示葛根黄酮和桑白皮提取物的配伍增效机制,本部分研究了葛根黄酮对桑白皮提取物中主要活性成分DNJ的药代动力学行为和肠吸收特性的影响,主要研究结果如下：1葛根黄酮对桑白皮提取物降糖活性的影响通过观测RPIF、桑白皮提取物(CME)及桑葛复方提取物(CME-RPIF)对大鼠糖耐量的影响,评价其单独及配伍应用时的降糖活性。结果显示,CME-RPIF可显著抑制口服淀粉溶液后血糖的升高。空白对照组、CME、RPIF和CME-RPIF组的血糖AUC0-t分别为8.71、7.52、7.68和5.16 h/mmol*L。CME-RPIF组血糖AUC与空白对照组比较明显降低,降低幅度为40.8%,而CME组和RPIF组则降低的较少,分别为13.6%和11.8%,且无统计学差异,表明CME与RPIF联用时,降糖活性得到显著提高。2建立生物样品中DNJ的LC-MS/MS含量测定方法建立了专属,灵敏的LC-MS/MS方法以测定大鼠血浆、尿液等生物样品中DNJ的浓度,该方法具有良好的线性,DNJ的最低检测限为5 ng/mL,最低定量限为10 ng/mL,同时呈现出较好精密度(RSD<16.09%)和准确度(Bias<13.37),血浆样品提取回收率在80.3-96.9%之间,均能达到生物样品分析方法学要求。3葛根黄酮对桑白皮提取物中DNJ体内药代动力学行为及肠吸收特性的的影响首次以体内整体实验大鼠模型、大鼠在体肠灌流模型和Caco-2细胞单层模型研究了葛根黄酮对桑白皮降糖有效成分DNJ的吸收和排泄的影响。研究结果表明,大鼠口服CME (DNJ 20 mg/kg或40 mg/kg)后,DNJ在0.4 h或0.35 h达到最大血药浓度5.79 μg/ml或10.66 μg/ml而给予CME-RPIF后(DNJ 20 mg/kg或40 mg/kg),大鼠对DNJ的吸收延缓,平均达峰时间为0.55 h或0.6 h,峰浓度明显降低至2.94 μg/ml或5.56 μg/ml同时给药后0-4 h内DNJ在尿液中的累积排泄率由48.76%降至33.86%,比较两组的半衰期未发现显著性变化,表明RPIF只改变DNJ的吸收速率,对其消除没有影响。以CME-RPIF对大鼠进行单向肠灌流时DNJ的有效渗透系数Peff为3.52×10-3 cm/min,远低于以CME灌流时的Peff 7.53×10-3cm/min。此结果表明,以CME-RPIF灌流时DNJ在大鼠肠道内的吸收受到显著抑制。在Caco-2细胞上进行DNJ的吸收特性研究结果表明,RPIF可显著抑制10μg/mL DNJ的吸收,使其表观通透系数Papp值由2.7×10-4下降至1.0 ×10-4 cm/min (p<0.01)。上述结果表明,RPIF可显著抑制CME中的主要活性成分DNJ的吸收,提高其在肠道的浓度,延长其肠道滞留时间,使其更好地发挥抑制葡萄糖苷酶活性,从而达到增强CME降低餐后血糖的作用。RPIF在增强CME降糖活性中具有重要作用。