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[目的]
本论文在课题组前期分离获得十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因序列的基础上,对推导的AdMn-SOD氨基酸序列进行生物信息学分析;进一步构建AdMn-SOD成熟蛋白原核表达系统,在大肠杆菌(E.coli)中融合表达AdMn-SOD,并分析纯化的重组AdMn-SOD的活性及温度、pH值对活性的影响。研究结果将为进一步研究AdMn-SOD的生物学功能并探讨其应用奠定基础。
[方法]
1.AdMn-SOD的生物信息学分析
运用生物信息学软件DNASTAR及DNAMAN分析前期获得的AdMn-SOD基因序列的阅读框(ORF);运用在线软件SignalIP3.0及TargetP program(http://www.cbs.dtu.dk/services)分别预测推测的AdMn-SOD的信号肽序列及其亚细胞定位;运用在线生物信息学软件BLAST搜索AdMn-SOD基因序列及其推导的氨基酸序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的同源性序列;在www.expasy.ch/Tools/protparam.html中分析推测的AdMn-SOD理化性质;在http://npsa-pbil.ibcp.fr上选用HNN法对推测的AdMn-SOD的二级结构和折叠类型进行预测;在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterproSCAN/中搜索推测的AdMn-SOD的功能域;运用CLUSTAL W程序比对分析AdMn-SOD与其它已报道线虫及部分代表性物种的Mn-SOD氨基酸序列;运用MEGA3.1软件中邻近法(neighbor-joining method)分析基于Mn-SOD氨基酸序列的AdMn-SOD与其它线虫及部分代表性物种Mn-SOD的进化树关系。
2.AdMn-SOD的原核表达
设计引物,扩增 AdMn-SOD成熟蛋白编码序列,扩增产物经 BamH I和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接,构建重组原核表达重组质粒。将构建好的重组表达质粒pET-32a/AdMn-SOD转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。
3.重组AdMn-SOD的活性检测
诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化,用Bradford法测定纯化蛋白的浓度,用超氧化物岐化酶检测试剂盒WST-1检测重组蛋白AdMn-SOD的超氧化物抑制百分率,测定其酶活性的单位,并分析温度、pH值对活性的影响。
[结果]
1.AdMn-SOD的生物信息学分析
推导AdMn-SOD cDNA完整ORF为648bp,编码216个氨基酸残基组成的多肽。AdMn-SOD包含有保守的与锰离子结合的3个组氨酸残基及1个天冬氨酸残基(His-46,His-94,Asp-178,His-182),具有Mn-SOD具有的"DVWEHAYY"保守结构。AdMn-SOD前端20个氨基酸残基组成信号肽序列,第21～216个氨基酸序列为其蛋白序列;经用TargetP预测,AdMn-SOD位于线粒体中。
用BLAST N及BLAST P程序在GenBank中检索相似性序列,结果显示AdMn-SOD基因序列及其推导的编码蛋白与秀丽小杆线虫、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergri)及中国对虾(Fenneropenaeus chinenMs)等线粒体Mn-SOD具有较高相似性。与其它线虫及部分代表性物种的Mn-SOD氨基酸序列比较及进化树研究表明,AdMn-SOD具有Mn-SOD的保守结构,且与线虫Mn-SOD亲缘关系较近。
2.AdMn-SOD的原核表达
运用RT-PCR技术扩增获得了AdMn-SOD的成熟蛋白编码序列,并成功构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒。构建好的重组表达质粒pET-32a/AdMn-SOD转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG能诱导目的蛋白AdMn-SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下可获纯化的重组AdMn-SOD可溶性目的融合蛋白量达44.4mg/ml。
3.重组AdMn-SOD的活性检测
纯化的重组AdMn-SOD活性(抑制率％)为95.5,酶活性单位为3169u/mg。pH值在6.5和9.5之间对其活性影响不大,其最适pH为8.5;随温度的升高,其活性逐渐降低,在90℃仍存在40%以上活性,因此可知重组AdMn-SOD对温度有较好的耐受性,在较高温度仍具有较好的酶活。
[结论]
经生物信息学分析,AdMn-SOD具有典型Mn-SOD的结构特征,与线虫Mn-SOD亲缘关系较近,与其他生物种Mn-SOD序列也具有较高相似性;成功构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒,表达了AdMn-SOD,重组AdMn-SOD具有较好生物活性,结果为进一步研究AdMn-SOD的生物性功能和特性奠定了基础。