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微小RNA(miRNAs)是广泛存在于真核生物中的高度保守的非编码小分子RNA，是转录后基因表达的调控者。深入研究昆虫miRNAs，对于研究阐明昆虫生长发育调控机制、复杂的生理机能以及环境适应机制、寻找害虫防治新途径等都有重要意义。本文探索建立了斜纹夜蛾和小菜蛾保守miRNA的克隆方法体系，定量研究了斜纹夜蛾和小菜蛾miR-14和miR-2α的表达特点，预测了斜纹夜蛾和小菜蛾miR-14作用于昆虫变态发育过程中的靶基因，克隆和表达了斜纹夜蛾miR-14的预测靶基因E75D，初步分析和研究了非模式昆虫中miR-14与E75的作用关系。主要内容和结果如下。 根据NCBI和miRNA数据库公布的昆虫成熟miR-14和miR-2α的序列，分别设计2组引物(茎环反转录引物+PCR上下游引物)用于斜纹夜蛾miR-14和miR-2α成熟序列的克隆，得到了与其它昆虫完全同源的21 bp的miR-14和23 bp的miR-2α。设计兼并引物克隆了长度分别为322 bp和522 bp的miR-14和miR-2α的部分初始序列，其中均包含约80 bp的miRNA前体序列，序列经mfold程序分析后表明符合miRNA前体的结构特点；2种前体序列分别包含了相应miRNA的成熟序列，且与茎环法得到的序列100％同源，验证了茎环法克隆miRNA序列的准确性。所得斜纹夜蛾miR-14和miR-2α分别命名为sli-miR-14和sli-miR-2α。 利用上述茎环引物克隆得到了小菜蛾miR-14和miR-2α的成熟序列，并与其它昆虫相应序列完全同源，命名为pxy-miR-14和pxy-miR-2α，进一步确定了茎环法鉴定非模式昆虫保守miRNAs的可用性。 为了验证克隆得到的miRNA是否为昆虫内源产生，利用荧光定量PCR分析了斜纹夜蛾和小菜蛾不同发育时期miR-14和miR-2α的表达水平。结果表明，斜纹夜蛾和小菜蛾miR-14和miR-2α的表达情况均类似，miR-14的表达水平在蛹期和预蛹期相对较低，在成虫期相对较高，而miR-2α在蛹期相对最高，在预蛹、成虫期相对最低。 采用PITA和RNAhybird程序预测了miR-14在鳞翅目昆虫变态发育过程中的靶基因。3种候选基因EcR、E75、Jhe3’UTR的同源性比对和miR-14结合位点分析结果显示，除棉铃虫和烟蚜夜蛾。Jhe3’UTR的序列一致性为80.4％以外，其余各虫Jhe同源基因3UTR的一致性均不超过50％；EcR3’UTR有两个完全保守的区域；E753UTR序列一致性均在89％以上。miR-14与各Jhe同源基因3UTR的预测结合位点均不相同，而与EcR、E75各同源基因3’UTR的预测结合位点非常保守，预测EcR和E75为miR-14的潜在靶标。 从斜纹夜蛾中首次克隆获得了sli-E75D的cDNA序列(GenBank No.JQ266225)，其开放阅读框全长1836 bp，编码611个氨基酸残基，3UTR全长为358 bp，同时获得其5UTR共341 bp。构建pET28a-sli-E75D，分别转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)和Transetta(DE3)，两种重组质粒经IPTG诱导后均表达出约74.79 kD(含预测的67.19 kDSli-E75D，7.6 kD T7·Tag和His·Tag)的重组蛋白，与预测分子量相符，Transetta(DE3)菌株的表达效果较BL21(DE3)好，IPTG适宜浓度为0.6mmol/L。 从小菜蛾中克隆得到了pxy-E75的部分序列，包含370 bp完整的3UTR。小菜蛾、斜纹夜蛾E753UTR的序列一致性高达85.8％，均包含与其他鳞翅目昆虫同源基因相似的miR-14结合位点。 利用荧光定量PCR分别测定了斜纹夜蛾8个发育时间点sli-E75和sli-miR-14的表达水平。结果表明，从预蛹到6日龄蛹期，sli-E75的表达量相对较高，蛹后期其表达量迅速降低，成虫期有所回升。从6龄幼虫到3日龄蛹期，sli-miR-14的表达量均相对较低，从6日龄蛹开始升高，在蛹后期达到高峰，成虫期稍有回落。两者的相对表达量基本成反相关，符合miRNA对靶基因的作用规律。 本文探索建立了非模式昆虫保守miRNAs的鉴定策略，首次利用茎环引物法克隆和鉴定了斜纹夜蛾和小菜蛾的miR-14和miR-2α，克隆获得了其靶基因E75D。结合研究结果，重点讨论了茎环法用于非模式昆虫保守miRNA鉴定的可行性、Sli-E75D的基因和蛋白结构特征、斜纹夜蛾miR-14与E75的作用关系等。全文结果不仅可为非模式昆虫miRNA的鉴定和功能研究提供研究模式，而且有助于更加深入全面理解斜纹夜蛾和小菜蛾复杂的生理功能和环境适应机制，为寻找害虫综合防治新技术提供参考。