【摘 要】
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目的:用不同浓度的羟基脲(HU)药物处理体外培养的K562细胞,观察细胞并检测细胞的抑制率和凋亡情况,然后检测其激活γ珠蛋白基因(简称HBG基因)的表达情况,了解HU激活γ珠蛋白基因表达K562细胞的细胞抑制与凋亡情况,探索通过HU诱导生成胎儿血红蛋白(Hb F)治疗重症β地中海贫血新方法,为研究HU用于治疗β地贫新途径的安全性和有效性提供可靠依据。方法:首先用CCK-8检测HU对K562细胞抑制
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目的:用不同浓度的羟基脲(HU)药物处理体外培养的K562细胞,观察细胞并检测细胞的抑制率和凋亡情况,然后检测其激活γ珠蛋白基因(简称HBG基因)的表达情况,了解HU激活γ珠蛋白基因表达K562细胞的细胞抑制与凋亡情况,探索通过HU诱导生成胎儿血红蛋白(Hb F)治疗重症β地中海贫血新方法,为研究HU用于治疗β地贫新途径的安全性和有效性提供可靠依据。方法:首先用CCK-8检测HU对K562细胞抑制率的影响,用不同浓度的HU作用于K562细胞24h、48h、72h后终止细胞培养,按CCK-8试剂说明书操作步骤,与相对应的细胞混匀,孵育在一定时间后用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,与对照组相比来反应出药物作用后,K562细胞受到的抑制情况。之后流式细胞术用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒,来检测不同浓度的HU作用于K562细胞24h、48h、72h后的细胞凋亡率。接下来采用实时荧光定量PCR(q PCR)检测目标HBG基因表达,用trizol法提取细胞总RNA,逆转录合成c DNA,根据Genbank公布的HBG基因(Genbank:NM000184)及内参基因GAPDH(Genbank:BC025925)m RNA全序列,利用Primer 6.0设计引物,然后开展实时荧光定量PCR对相对应的m RNA表达量做检测,并进行相对m RNA表达水平计算。结果:从不同浓度的HU中分析得出在HU浓度大于100um/L小于1000um/L作用时间为72h时,细胞观察到存活受到的明显抑制。因此设置了浓度梯度为0nm/L、50nm/L、100nm/L、200nm/L、300 nm/L、50um/L、100um/L、200um/L8个浓度以及24h、48h、72h三个时间段来培养K562细胞进行后续实验操作。通过CCK-8试剂盒、流式细胞仪、实时荧光定量PCR,测定三个时间段,不同浓度药物作用的细胞发现0nm/L、50nm/L、100nm/L、200nm/L、300nm/L这五个浓度三个时间段的抑制率、细胞凋亡率和HBG基因m RNA的表达量没有明显差异(P>0.05),且50um/L、100um/L、200um/L仅在72h相较于前对照组及50nm/L、100nm/L、200nm/L、300nm/L这四个浓度有明显差异(P<0.05)。且浓度越高,其细胞的抑制率越高,细胞m RNA也随着浓度的升高表达量升高。结论:我们的实验证明,HU对K562细胞的HBG基因的表达有促进作用,且作用于K562细胞的HU的最佳浓度为100um/L及最佳作用时间72h,为后续的课题项目进展提供基础研究与判断。
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