论文部分内容阅读
水稻褐飞虱(Nilaparvata lugens St(a)l)是水稻的主要害虫之一，对世界尤其是亚洲的水稻生产造成了严重破坏。本研究采用国际上首次克隆的新型Bt晶体蛋白基因Cry30Fa1和Cry54Aa1对褐飞虱进行抗虫性鉴定和蛋白质工程改造以及抗褐飞虱转基因水稻培育，以达到防治褐飞虱的目的。 首先，本研究对Cry30Fa1和Cry54Aa1进行原核表达，获得纯化蛋白，并进行抗虫性测定。结果表明它们对褐飞虱的半致死浓度(LC50)分别为96.58μg/ml和248.27μg/ml，Cry30Fa1的杀虫活性强于Cry54Aa1。随后在不改变其氨基酸序列的前提下，对Cry30Fa1和Cry54Aa1按照水稻优势密码子进行序列优化，同时加入Ω序列，Kozak序列等增强元件，构建水稻转化载体，并获得了转基因水稻株系。我们重点研究了Cry30Fa1转基因株系。qPCR检测结果表明Cry30Fa1的表达量可以达到内参基因Actin的4～5倍。Western blot及ELISA结果表明部分转基因株系目的蛋白积累水平可达水稻总蛋白的0.1～0.8‰。在飞虱爆发时，进行田间抗性调查，结果显示转基因植株对褐飞虱抗性明显，最高可达1级抗性，并获得可稳定遗传的纯合株系。有望用于转基因抗飞虱水稻新品种的培育。 其次，本研究将Cry30Fa1和Cry54Aa1的结构域Ⅱ和结构域Ⅲ分别与不同的Cry蛋白进行结构域互换的改造，共得到12株新型杂合蛋白。将其进行原核表达、纯化后进行抗褐飞虱生物活性测定，结果表明结构域Ⅱ来源于Cry54Aa1的两个改造HY151b及HY151c对褐飞虱的LC50分别为6.21μg/ml及6.41μg/ml，较野生型Cry54Aa1提高38倍。下一步，本研究将对活性增强的杂合蛋白基因HY151b及HY151c进行序列优化及水稻转化载体的构建，并进行水稻转化，以期获得抗性更强的转基因水稻株系。 本研究为国际上首次成功地利用Cry杀虫蛋白对褐飞虱进行防治，初期结果表明转基因水稻获得了比较优良的抗性。同时通过结构域互换的方式成功的对Cry30Fa1，Cry54Aa1进行了活性增强的改造，有望培育出抗性水平更高的抗褐飞虱转基因水稻新品种。