布鲁菌病是一种重要的人畜共患病。主要引起反刍动物流产、不育和人类的慢性感染和波状热。在全世界广泛分布,对人类的健康和畜牧业的发展造成严重的危害。目前准确诊断该病是控制布鲁菌病的关键。传统检测方法的敏感性和特异性不理想,且实验条件要求高。常见的血清学诊断方法有假阳性现象存在。因此,开发一种灵敏、便捷、特异的检测方法对于布鲁菌病诊断具有十分重要的意义。在本研究中,我们完成了三部分研究内容:1)布鲁菌已报道主要免疫原性蛋白的筛选。通过对BALB/c小鼠腹腔注射流产布鲁菌S2308株的方法,建立小鼠感染模型。评估了已报道的布鲁菌主要免疫原性蛋白的OMP16、BP26、BLS、BCSP31、VirB12、SodC和GroEL在布鲁菌感染不同阶段抗体生成规律,探讨了它们在布鲁菌病诊断中的应用。在随后研究中,通过免疫印迹试验评估了7种蛋白对44例临床牛血清的检测效果。2)筛选流产布鲁菌新的免疫原性蛋白。通过免疫印迹试验分析流产布鲁菌感染小鼠不同阶段的血清中以及临床牛羊布鲁菌病阳性血清中抗体生成规律和特点,确定布鲁菌主要免疫原性蛋白的相对区域。通过SDS-PAGE分离布鲁菌总蛋白,对照免疫印迹试验结果,切胶回收免疫原性蛋白条带进行质谱分析,随后,在大肠杆菌中成功表达和纯化了免疫原性蛋白SSB,并对其反应原性进行了后续分析。3)布鲁菌胶体金试纸条的初步制备。首先,基于BP26-ELISA、BLS-ELISA和LPS-ELISA检测临床牛血清,结果发现LPS依然是用于布鲁菌检测最优的抗原。之后,以提纯的LPS为抗原制备胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,通过对胶体金封闭液、重悬液及NC膜等条件进行优化,确定以SPG标记胶体金颗粒,以提纯LPS作为检测线,羊抗鼠IgG作为质控线,制备布鲁菌病快速检测试纸条。结果表明,1)在7种布鲁菌主要免疫原性蛋白中,BP26和BLS是两种最佳的免疫原性蛋白。BP26和BLS与30例布鲁菌病阳性血清发生了反应,但同时与14例布鲁菌病阴性血清也产生了假阳性反应。间接ELISA分析,BP26-ELISA与LPS-ELISA相比,检测布鲁菌病阳性血清的符合率为92.68%,而检测阴性血清的符合率仅为52.94%。BLS-ELISA同样难区分布鲁菌病阳性血清和阴性血清。LPS-ELISA可以显著区分阳性和阴性布病样本。同时,以不同截断的BP26蛋白片段为抗原同样不能排除与布鲁菌病阴性血清产生的假阳性反应。2)免疫印迹试验分析感染小鼠血清和临床牛羊血清,发现布鲁菌免疫原性蛋白主要集中在相对分子量40~70kDa和7~20kDa的两个区域。质谱分析共鉴定到6个布鲁菌免疫原性蛋白。免疫印迹试验发现,SSB蛋白与临床布鲁菌病牛血清具有较好的反应原性,与虎红平板凝集试验的符合率约为82%。3)以提纯LPS为抗原制备胶体金试纸条,确定了最适pH、蛋白标记量、NC膜、稳定液与重悬液等条件,初步制备了布鲁菌病检测胶体金试纸条,检测牛布鲁菌病标准阴性和阳性血清反应,结果与预期结果一致。综上所述,我们发现BP26和BLS尽管为布鲁菌较好的免疫原性蛋白,但作为抗原用于布鲁菌病诊断会产生假阳性反应,造成误诊。此外,SSB蛋白与临床布鲁菌病牛血清具有较好的反应原性,与虎红平板凝集试验的符合率约为82%。间接ELISA分析发现,LPS依然是布鲁菌最重要的抗原。以LPS为检测抗原,初步研制了检测布鲁菌病的胶体金试纸条,并且可以在5min内获得实验结果。该研究为布鲁菌病诊断试剂的研发奠定基础。