本研究的主要目的是通过建立体细胞核移植(SENT)方法，在体外条件下获得兔一兔同种或人一兔异种克隆囊胚，为以后从克隆囊胚的内细胞团分离培养出全能性的胚胎干细胞并用于治疗性克隆等研究提供实验依据和方法。本研究从重构胚的激活、受体卵母细胞的来源、克隆胚胎的体外培养及兔卵丘细胞和骨髓基质细胞(rBMSCs)用作核供体等几个方面进行了较为系统的研究以提高SCNT的效率。此外，利用人骨髓基质细胞(hBMSCs)用作核供体进行了人—兔异种克隆的初步探索并获得了异种克隆囊胚。主要内容如下： 为了提高兔体细胞核移植(SCNT)胚胎的体外发育效果，通过不同激活剂采用不同联合处理对兔SCNT的重构胚进行激活，以遴选出适合于本实验室条件下较为理想的激活方案，结果表明：兔SCNT重构胚先用5 μM ION避光处理4min，洗涤后再移入含2mM 6-DMAP和7.5μg/ml CB的mM-199(添加有10％FBS的TCM-199)中培养3h的激活效果较为理想，获得了73.3％的分裂率以及22.2％的囊胚率。虽然采用的激活方法与胚胎体外培养液各不相同，但改进的激活方法获得的实验结果达到国内外已有兔SCNT报道的相同水平。 为了降低实验成本，获取更多的卵母细胞州丁SCNT，本研究国内外首次采用抽吸自PMSG或FSH超排母兔排卵结束(HCG注射14h)后卵巢表面残留卵泡内的卵母细胞用于SCNT研究，并同时与排出到输卵管内的卵母细胞进行比较。结果表明：PMSG和FSH超排获得的抽吸组成熟卵母细胞(以可见第一极体为准)的比率分别极显著和显著低于各自的排出组(PMSG：70.7％vs94.6％，P<0.01；FSH：81.5％vs 94.6％，P<0.05)，且PMSG和FSH抽吸组问卵母细胞的成熟率差异显著(70.7％vs 81.5％，P<0.05)。PMSG和HCG超排的抽吸组成熟卵母细胞的去核效率也显著低于各自的排出组(PMSG：抽吸vs排出=69.2％vs 83.6％，P<0.05；FSH：抽吸vs排出=71.6％vs81.0％，P<0.05)。抽吸组成熟卵母细胞的注核效率以及此类卵母细胞用作胞质受体经体细胞移植后的重构胚在融合率、分裂率以及分裂胚胎发育至囊胚的比例与排出组差异均不显著(JP>0.05)。但是，PMSG超排后的抽吸组成熟卵母细胞体细胞核移植的总体效率显著低于其排出组(8.4％vs11.5％，P<0.05)，而FSH超排的结果抽吸组与排出组差异则不显著(10.2％vs 11.6％，P>O.05)。结果显示：抽吸白超排兔卵巢表面卵泡内的卵母细胞人多数都已经成熟，获得的重构胚与源自排出剑输卵管内的卵母细胞的重构胚具有等同的发育能力，可以不经体外成熟培养而直接用于体细胞核移植，而且FSH超排获得的抽吸组卵母细胞体细胞核移植的总体效率与排出到输卵管内的卵母细胞没有显著差别。 为了提高兔SCNT胚胎体外发育至囊胚阶段的比例，首次在体外培养阶段添加不同浓度(O、10和20gM)的β-巯基乙醇(β-ME)米检测β-ME的添加对兔孤雌生殖和体细胞核移植胚胎体外发育能力和囊胚质量的影响。结果显示：在mM-199添加10μM β-ME后显著提高了孤雌生殖和SCNT胚胎的分裂率以及胚胎各阶段的发育能力(p<0.05)。通过对孤雌生殖胚胎首先在10uM的B．ME中培养12小时后，分裂的2～4细胞胚胎再分别用添加0、10、20gM的β-ME体外培养液继续培养的研究进一步发现，β-ME的这种促进作用主要在胚胎开始培养的前12h内(≤4细胞阶段)起作本研究选择具有临床应用价值的骨髓基质细胞(BMSCs)为核供体进行核移植，建立了兔SCNT的方法，重构胚的分裂率为65.2％，分裂后胚胎发育至囊胚阶段的比例为26.7％，获得的囊胚有62.5％进入孵化阶段；孵化出来的细胞贴壁生长并向周围扩展，显示了具有向下一阶段发育的潜能。实验结果表明以兔成体体细胞的骨髓基质细胞为核供体，经克隆技术生产出囊胚并从中分离内细胞团细胞具有可行性，为进一步从囊胚内细胞团细胞中分离并培养出胚胎干细胞提供了克隆源性的囊胚。 在已经建立的兔骨髓基质细胞(rBMSCs)核移植方法的基础上，首次探讨了利用人骨髓基质细胞(hBMSCs)构建人—兔异种克隆胚胎的方法，并通过用rBMSCs和兔卵丘细胞用(rCCs)做核供体的同种克隆进行比较，米评估hBMSCs用作核供体的克隆效率。结果显示，与用于同种克隆的融合电压(2.0k V/cm)相比，人—兔异种克隆重构胚的融合率很低，但可以通过提高的融合电压强度(2．4kV/cm)极显著提高hBMSCs—兔异种克隆重构胚的融合率(60.0％vs 39.6％，P0.05)，而改进的直接注核法也可以提高显微操作的总体效率(78.4％vs 68.9％，P<0.05)以获得更多的重构胚。虽然，由hBMSC重构的人—异种克隆胚胎发育至囊胚的比例极显著低于由rCCs和rBMSCs构建的同种克隆囊胚，但依旧有少量重构胚发育至囊胚阶段(4.8％～6.1％vs 27.3％和21.4％，P<0.01)。实验结果表明，以人骨髓基质细胞为核供体，经异种克隆技术可以生产山囊胚，但是效率非常低，需要进一步的研究米提高异种克隆囊胚体外生产的效率。 综上所述，本研究以兔卵丘细胞、兔骨髓基质细胞和人骨髓基质细胞为核供体，以超排母兔排卵结束(HCG注射14h)后排出到输卵管内或卵巢残留卵泡内成熟的MⅡ卵母细胞去核后为胞质受体，构建的同种或异种克隆胚胎能够通过体外培养在体外发育至囊胚阶段，取得了一定的创新性研究结果。