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褪黑素(melatonin,MLT)是大脑下部松果体分泌的重要激素,由色氨酸合成,属于吲哚类物质。在体内可以与特定受体结合产生一定的生物学效应,主要有:免疫调节作用,可以增强免疫力、抗肿瘤和降血压；清除自由基及抗氧化作用,可以对细胞核DNA起到保护作用,还可以保护大脑免受自由基氧化损害。褪黑素的体内分泌受年龄的影响,随年龄的增大分泌减少,成年人适当补充外源性褪黑素可以延缓衰老,还可预防高血压,心脏病,动脉硬化等多种老年性疾病；神经系统方面可以起到镇静调节中枢神经的作用,常用于消除时差反应,改善睡眠障碍等疾病；在生殖系统方面,有抑制性腺和副性腺发育,用于皮毛动物饲养上可以促进其皮毛发育和成熟,提高经济效益。褪黑素为内源性物质,毒副作用小,用途广泛,有广阔的开发应用前景。
目前,褪黑素用于人体的剂型有片剂和口服液等；用于动物增加皮毛生长的剂型有缓释片或硅胶管埋植棒,现已上市的硅胶管埋植棒可缓释3个月。由于褪黑素口服首过效应大,生物利用度低,半衰期短,需频繁或大剂量给药,限制了其在人和动物体中的应用。
本课题采用生物相容性好、生物可降解的磷脂、胆固醇和乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacids,PLGA)等载体材料将褪黑素制备成脂质体及微球等长效缓释制剂,并且将脂质体、微球与以具备热反相胶凝特性的泊洛沙姆407(商品名PluronicF127,PF127)为载体材料制备原位凝胶,用于皮下注射植入。既可以达到长效缓释的效果,又有效的避免了生物不可降解材料植入剂生物相容性差,植入过程复杂以及给病人带来痛苦等缺点。为进一步开发褪黑素广泛的生理学用途提供了可能。本文主要研究内容包括:
1褪黑素脂质体的研究建立了MLT的含量测定方法；采用薄膜分散法制备MLT脂质体；以包封率为主要评价指标,在单因素考察的基础上,采用均匀设计优化处方和工艺；通过电子透射显微镜观察脂质体外观形态；激光散射粒度仪测定粒径和Zeta电势；以褪黑素溶液为对照,采用动态膜透析法测定MLT脂质体体外释放百分率并对其释药动力学进行研究；通过影响因素考察评价MLT脂质体初步稳定性。结果表明,紫外分光光度法作为测定脂质体中MLT含量的方法,专属性强、重现性及灵敏性好,操作简便；在单因素考察基础上,经均匀设计试验得最优处方为:药脂比为1:25、磷脂与胆固醇的质量比为10:1,温度40℃；透射显微镜下观察脂质体外观形态为圆整的球形小囊,平均粒径为(5.542±0.04)μm,Zeta电势为(-31.68±1.29)mV,包封率为(77.23±2.51)％；与MLT溶液相比,MLT脂质体体外释药有明显的缓释作用(从10h延长至72h),体外释药更好地符合双相动力学数学模型(100-Q=105.64e-0.3156t+44.19e-0.0492t,Rα=0.9886,Rβ=0.9874)。初步稳定性试验表明脂质体更宜低温保存。
2褪黑素PLGA微球的研究采用O/W型乳化-溶剂挥发法制备褪黑素PLGA微球,紫外分光光度法测定微球的包封率及载药量。以包封率为评价指标,在单因素考察的基础上,采用正交设计试验优化处方和工艺；采用光学显微镜观察微球的外观形态；激光散射粒度分析仪测定微球的粒径及粒度分布；动态膜透析法测定MLT-PLGA-MS体外释放行为,以零级动力学方程,一级动力学方程、Higuchiequmion、Weibullequmion、Ritger-Peppasequation和Bioexponentialequation等数学模型对微球体外释药动力学特性进行拟合,分析体外释药机理；采用DSC法验证微球的形成；通过微球初步稳定性考察,为将来制剂的包装及贮存条件提供试验依据。
单因素考察结果表明影响微球包封率的主要因素为聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)浓度、PLGA浓度、二氯甲烷和丙酮体积比。经正交设计试验筛选的最优处方及制备工艺为:PVA浓度为3％,PLGA的浓度为40mg·mL-1,二氯甲烷和丙酮体积比为3:1,机械搅拌制备初乳的速度与时间为2,000r·min-1、90s,磁力搅拌除去有机溶剂的速度与时间为400r·min-1、4h；加入2％的甘露醇作为冻干保护剂,采用低温冷冻干燥法制备干燥MLT微球；DSC试验结果验证了微球的形成。采用优化处方和工艺制备的三批褪黑素PLGA微球,外观为白色粉末,光学显微镜下观察其外观形态为球形,无粘连；平均粒径为(15.605±2.19)μm；平均包封率为(76.57±1.64)％；体外释放可持续3个月,服从零级释放模型(Q=0.0347t+3.5569,r=0.9549),呈现良好的缓释效果；加速试验及长期试验条件下考察,6个月内无明显变化,稳定性良好。
3褪黑素脂质体、褪黑素微球原位凝胶剂的制备及体外释药性研究采用倾斜法测定凝胶的胶凝温度,以能否获得适宜胶凝温度(20～36.5℃)及室温条件下凝胶的通针性为依据筛选PF127原位凝胶处方,将制备的褪黑素脂质体和微球分散于原位凝胶中,以MLT凝胶剂为对照,采用动态膜透析法测定MLT脂质体凝胶剂和MLT微球凝胶剂体外释药特性,并分别进行数学模型拟合,分析其释药机理。结果表明,制备脂质体及微球凝胶的PF127最优浓度为18％；制备的脂质体原位凝胶和微球原位凝胶胶凝温度分别为(23.3±0.3)℃和(22.8±0.4)℃,且在20℃以下通针性良好；体外释放试验结果表明,MLT脂质体凝胶剂与MLT凝胶剂相比有较好的缓释效果(释放时间从36h延长到120h),体外释放服从一级动力学模型(ln(100-Q)=-0.0258t+4.2292,r=0.9695)；MLT微球凝胶与MLT凝胶剂相比有明显的缓释效果(释放时间从36h延长到2184h),体外释放服从零级动力学模型(Q=0.037t+1.6731,r=0.9661)。由此可知,MLT微球凝胶剂较MLT脂质体凝胶剂缓释效果更明显。
4MLT-MS-GEL药代动力学研究采用高效液相色谱电化学检测器测定大鼠血浆中褪黑素浓度,建立血药浓度检测方法并进行方法学考察。将释放持续时间最久的原位凝胶制剂皮下注入大鼠皮下,以市售可缓释3个月的动物用硅胶管植入棒为对照制剂,对制备的长效缓释原位凝胶制剂进行体内药动学研究。
方法学考察结果表明,所选色谱条件及药物提取方法专属性好,灵敏度高,内源性物质不干扰药物的测定。血药浓度在0.1～10μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(A=9829.4c-2155,r=0.9991),日内、日间精密度RSD分别为小于3％和5％,方法回收率大于98％,提取回收率大于75％,RSD均小于3％,满足生物样品测定要求。
以市售动物用硅胶管植入棒为对照,研究大鼠皮下注射褪黑素微球原位凝胶后体内的药动学特性,血药浓度-时间数据采用DASver2.0药代动力学程序处理,按统计矩法求得到药动学参数,结果表明,对照组和微球组血浆中AUC分别为5358.566μg·mL-1·h-1和5562.251μg·mL·h-1；平均滞留时间(MRT)分别为1014.304h和1090.405h；t1/2分别为68.593h和69.315h；表观分布容积分别为0.330L·kg和0.181L·kg,对照组为微球组的1.82倍。结果表明,制备的MLT微球原位凝胶在动物体内可以达到与市售硅胶管埋植棒相同的效果,更多的药物进入体内大循环。由血药浓度曲线可见,在体内释放后期,微球原位凝胶维持比硅胶管埋植棒略高的血药浓度,达到稳定血药浓度的效果。
结论:本课题将褪黑素脂质体和微球制剂与原位凝胶结合起来,成功研制了具有长效缓释效果的褪黑素新型可注射植入剂。脂质体、微球制剂的制备工艺简便可行,具有良好的重现性和理想的包封率,体外释放有明显的缓释效果。将其以注射剂(静脉注射或皮下注射)应用于人体,能延长药物半衰期,提高生物利用度,扩大其临床应用范围。
将褪黑素脂质体和微球分散于一定浓度的PF127原位凝胶中,制备常温下可注射给药的脂质体、微球原位凝胶。选择其中体外释放时间最长的微球凝胶制剂进行大鼠体内药动学考察,与市售硅胶管埋植剂相比可发挥同样的缓释长效作用,与此同时还避免了硅胶管植入剂在应用上的不足,不需手术植入,只需通过注射器皮下注射即可在植入部位形成药物贮库缓慢释放药物。PLGA为生物可降解载体材料,降解产物为二氧化碳和水,无毒且药物释放完毕后不需手术取出,使治疗更加简便,提高患者用药顺应性,为褪黑素植入剂在人体上的应用提供可能性,具有广阔的应用前景。