研究背景:人体快速进入高原时,低压低氧是导致机体运动能力下降的主要原因。这时预先进行阶梯习服是最好的预防措施,然而未来军事斗争需要部队快速进驻高原并迅速投入战斗,因此上述习服方式在战时的意义不大,需要针对急进高原部队进行合理的外源性药物或营养补充剂的干预,据报道目前可预防高原反应的药物多数具有副作用,因此寻找副作用小,能够预防高原反应并增强机体运动耐力的药物或营养补充剂显得尤为重要,相关研究目前已成为运动医学,军事医学和营养学跨学科交叉的热点。回顾文献并根据本课题组前期实验发现,多酚活性化合物因具备良好的抗氧化、清除自由基等多种生物学活性,其应用前景日益受到重视,且多项研究证实其中的代表物槲皮素可以增强机体有氧运动能力和骨骼肌线粒体生物合成。因此本研究提出科学假设:急性低压低氧条件下机体产生的运动不耐受,主要机理可能是因线粒体功能紊乱并导致的骨骼肌损伤,而多酚活性化合物可能通过作用于骨骼肌线粒体而对急性低压低氧条件下机体的运动耐力具有保护效应。研究目的:1.通过低压氧舱建立急性低压低氧大鼠跑步力竭运动损伤模型,明确多酚活性植物化合物对急性低压低氧大鼠运动耐力的保护作用,并筛选出有效的化合物;2.阐明急性低压低氧环境下骨骼肌线粒体代谢紊乱与运动耐力下降之间的关系,揭示多酚活性化合物产生运动保护作用的分子机制。实验方法:第一部分:常见多酚活性化合物对急性低压低氧条件下大鼠运动能力的影响1.实验大鼠分组给药:即平原常氧对照组,低压低氧对照组,红景天阳性对照组,槲皮素干预组,杨梅素干预组,二氢杨梅素干预组,白藜芦醇干预组。每种药物组再根据设定的给药剂量分为50mg/kg.bw/d、75 mg/kg.bw/d、100mg/kg.bw/d、150mg/kg.bw/d、200mg/kg.bw/d组,预先连续灌胃7天,每天1次。2.利用低压氧舱模拟高原急性低压低氧条件,并在转轮式跑步机上完成大鼠跑步力竭实验来评价大鼠的运动能力,并观察杨梅素,二氢杨梅素,槲皮素和白藜芦醇等四种常见多酚活性化合物预防性干预后对急性低压低氧条件下大鼠力竭时间的影响;3.跑步力竭实验后收集大鼠血清,利用全自动生化分析仪检测血清中常规代谢指标尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平;4.收集大鼠腓肠肌标本,利用透射电镜观察各组大鼠骨骼肌超微结构的形态变化。第二部分:二氢杨梅素对骨骼肌微损伤的保护作用及机制研究第一节二氢杨梅素通过防止线粒体代谢紊乱来保护骨骼肌微损伤1.二氢杨梅素选取三个剂量组以及力竭实验对照组大鼠标本,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠骨骼肌细胞呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性;2.提取大鼠腓肠肌组织线粒体DNA,采用实时定量PCR检测线粒体DNA的表达;3.采用Western blot方法检测大鼠腓肠肌组织线粒体分裂融合相关蛋白表达。第二节SIRT3基因在二氢杨梅素保护骨骼肌微损伤效应中的作用和机制1.实验小鼠分组及给药方案:野生小鼠随机分为野生小鼠静止对照组、野生小鼠运动对照组和野生小鼠DHM运动实验组;SIRT3基因敲除小鼠随机分为基因敲除小鼠运动对照组和基因敲除小鼠DHM运动实验组,DHM取剂量统一为100 mg/kg.bw/d,预先连续给药,共持续4周;2.建立小鼠转轮跑步骨骼肌微损伤模型,除静止对照组外,其余四组均连续进行4周的转轮跑步疲劳性运动,完成后次日进行一次跑步力竭实验,24小时后处死并收集小鼠血清和腓肠肌标本;3.采用试剂盒检测小鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平,以及骨骼肌组织中丙二醛(MDA)含量;4.利用透射电镜观察小鼠腓肠肌超微结构的形态变化;5.采用Western blot方法检测小鼠腓肠肌组织SIRT3及线粒体功能调节蛋白表达;6.利用免疫共沉淀检测小鼠腓肠肌组织SIRT3-OPA1蛋白表达;7.利用免疫组织化学染色检测小鼠腓肠肌SIRT3及线粒体功能调节蛋白表达。第三部分:杨梅素在低氧环境维持骨骼肌细胞线粒体生物合成及机制研究1.培养L6大鼠骨骼肌细胞并诱导分化,用real-time PCR方法检测MYO和MHC的基因表达来明确L6细胞分化程度。分化后,将细胞分为5组:常氧对照组,低氧对照组,杨梅素干预组,SIRT1抑制剂+杨梅素干预组和AMPK抑制剂+杨梅素干预组。将后四组置入低氧细胞培养箱进行16小时的低氧处理;2.采用JC-1方法测定L6大鼠骨骼肌细胞线粒体膜电位变化;3.选取杨梅素三个剂量组及力竭实验对照组的大鼠标本,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠骨骼肌细胞呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性;4.利用透射电镜观察大鼠骨骼肌线粒体超微结构的形态变化;5.采用Real-time PCR方法检测大鼠腓肠肌组织和L6骨骼肌细胞线粒体DNA的表达;6.采用Western blot方法检测大鼠腓肠肌组织和L6骨骼肌细胞线粒体生物合成相关蛋白表达;7.利用免疫组织化学染色检测大鼠腓肠肌组织线粒体生物合成相关蛋白表达;8.利用免疫荧光化学染色检测L6骨骼肌细胞线粒体生物合成相关蛋白表达。实验结果:一、多酚活性化合物槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素在急性低压低氧环境下对大鼠运动能力有明显的保护作用。1.急性低压低氧环境下大鼠的跑步力竭时间大幅缩短,明显低于平原常氧对照组大鼠;2.四种常见多酚活性化合物中,除白藜芦醇外,槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素预先干预后大鼠的力竭时间与低压低氧对照组大鼠相比明显延长,但剂量-效应曲线有所不同,杨梅素和二氢杨梅素的效用比较突出且类似,在75mg/kg.bw/d剂量组即可产生明显的效应,而槲皮素需剂量达150mg/kg.bw/d时才能发挥作用,且效果不及杨梅素和二氢杨梅素;3.急性低压低氧条件下大鼠运动力竭后,其血清BUN、LDH和CK三个代谢指标水平均显著升高;4.四种常见多酚活性化合物中只有杨梅素和二氢杨梅素对BUN的影响显著,二者实验组大鼠与高原低氧对照组相比血清BUN值明显下降,而槲皮素和白藜芦醇对BUN的作用甚微,即便是最高剂量组200mg/kg.bw/d,血清BUN值也只是略有下降,统计学无显著差异;5.四种常见多酚活性化合物中只有白藜芦醇对LDH的作用不明显,其余均可降低大鼠在急性低压低氧条件下跑步力竭后血清LDH值,三者的剂量-效应曲线区别较大,其中杨梅素的作用最强;6.四种常见多酚活性化合物中只有白藜芦醇对血清CK的作用不大,其余三种均可不同程度的降低大鼠在急性低压低氧暴露下力竭后血清CK水平,其中二氢杨梅素的作用最明显;7.急性低压低氧条件下大鼠骨骼肌超微结构表现为不规则的肌原纤维,Z线模糊且出现散乱,肌质网开始溶解,而二氢杨梅素干预可显著减轻上述损伤,但其余几种化合物干预后改善不明显。二、二氢杨梅素在急性低压低氧环境下能有效减轻大鼠骨骼肌超微结构损伤,维持骨骼肌线粒体代谢动力学并保护线粒体增殖以及呼吸链活性。1.在急性低压低氧环境下大鼠骨骼肌的四种线粒体呼吸链酶复合体活性均受到明显的抑制和损伤,当二氢杨梅素干预剂量达到100mg/kg.bw/d时能够有效的保护酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性,但对酶复合体Ⅴ的作用并不明显;2.急性低压低氧环境下大鼠骨骼肌细胞线粒体DNA的相对含量急剧降低,而二氢杨梅素干预后,线粒体DNA的相对含量有显著提升,并且呈现出剂量依赖性;3.急性低压低氧环境对大鼠骨骼肌线粒体分裂融合相关的四种调控蛋白的表达影响很大,其中MFN1和MFN2下降明显,DRP1和FIS1则显著上升,而通过二氢杨梅素干预后上述融合蛋白和分裂蛋白的变化趋势在100mg/kg.bw/d剂量组得到有效抑制。三、SIRT3是二氢杨梅素保护骨骼肌微损伤效用中的关键调节因子1.二氢杨梅素对野生小鼠过度运动导致的骨骼肌微损伤有明显保护作用;2.二氢杨梅素对SIRT3基因敲除小鼠过度运动后骨骼肌微损伤无明显保护作用;3.二氢杨梅素对小鼠过度运动导致的PGC-1α和ERRα表达下调有明显的遏制作用,而且这种作用效果并不受SIRT3基因敲除的影响;4.免疫共沉淀的结果显示SIRT3-OPA1相互作用密切,而Western blot实验检测显示疲劳性运动导致线粒体代谢动力学向分解代谢发展,而二氢杨梅素干预后这种趋势得到有效抑制,但这种作用对过度运动的SIRT3基因敲除小鼠没有效果。四、杨梅素在常氧条件和急性低氧条件下均能促进大鼠骨骼肌细胞线粒体生物合成,并可保护线粒体呼吸链酶复合体活性和膜电位,从而纠正线粒体的功能紊乱。1.急性低压低氧条件下大鼠骨骼肌细胞线粒体结构损伤明显,而杨梅素干预能有效抵抗这种损伤,并呈现出剂量依赖性;2.急性低压低氧暴露并跑步力竭后,大鼠腓肠肌细胞的四种线粒体呼吸链酶复合体的活性都显著下降,预先服用杨梅素且剂量达到100mg/kg.bw/d时,酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性有明显上升;3.急性低氧处理后L6骨骼肌细胞线粒体膜电位显著下降,而杨梅素预处理后能够在很大程度上阻止膜电位的下降趋势;4.杨梅素对急性低氧环境下大鼠腓肠肌和L6骨骼肌细胞线粒体DNA的下降均有明显的遏制作用,同时杨梅素在急性低氧条件下能够维持大鼠腓肠肌细胞以及L6骨骼肌细胞线粒体生物合成相关因子PGC-1a、NRF1和TFAM的蛋白表达;5.常氧环境下杨梅素干预可明显促进大鼠骨骼肌线粒体mt DNA相对含量以及PGC-1a,NRF1和TFAM这三个生物合成指标的蛋白表达;6.急性低压低氧暴露并跑步力竭后,大鼠骨骼肌中AMPK和SIRT1两个因子的表达显著下降,而预先补充杨梅素后可明显抵抗这种下降趋势;7.使用AMPK特异性抑制剂可以几乎完全消除杨梅素在低氧条件下对L6细胞线粒体生物合成的保护效应,而SIRT1抑制剂则没有这种作用。结论:1、多酚类活性化合物槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素可以明显减轻急性低压低氧环境下机体运动耐力的下降,其中二氢杨梅素和杨梅素的作用更为显著,二者的效应均表现出剂量依赖性,在100mg/kg.bw/d这一剂量水平即达到作用最大化。2、二氢杨梅素在急性低压低氧环境下能通过维持骨骼肌线粒体代谢动力学即分裂融合的平衡有效减轻大鼠骨骼肌超微结构损伤,另外对骨骼肌线粒体呼吸链活性以及增殖都有保护效应,这可能是其防止运动耐力下降的重要原因。3、SIRT3基因在二氢杨梅素减轻骨骼肌微损伤过程中发挥关键作用,其中PGC-1α-SIRT3-OPA1这一作用通路可能是二氢杨梅素发挥作用的靶点,最终依靠这一通路介导骨骼肌线粒体代谢动力学(分裂融合)状态而实现上述效应。4、杨梅素通过促进骨骼肌细胞线粒体生物合成并保护线粒体结构和功能达到在急性低压低氧暴露下保护大鼠运动能力的效果。其中促进线粒体生物合成的机制可能是通过AMPK-PGC-1a以及AMPK-SIRT1-PGC-1a通路而实现的。综上所述,本研究首次发现杨梅素和二氢杨梅素在急性低压低氧条件下对大鼠的运动能力有明显的保护效应,二氢杨梅素主要通过保护骨骼肌微损伤,而杨梅素主要通过促进骨骼肌线粒体生物合成,这与以往抗高原反应药物的作用靶点有所区别,该研究进一步开拓了抗高原反应药物的研究思路。同时为解决急进高原人员快速适应低压低氧环境提供了新的策略。