合欢皮抑制血管新生有效组分分离与其作用机制探讨

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肿瘤的生长、转移都要依靠肿瘤血管新生为之提供营养和途径,因此通过抑制肿瘤血管新生就成为肿瘤治疗的一种重要方法。血管内皮细胞在血管发生中具有重要作用,通过抑制它的增殖可以抑制肿瘤血管生成,进而抑制肿瘤的恶性生长和转移。本论文用HMEC-1(人微血管内皮细胞)作为药物活性筛选模型,从合欢皮有效组分中分离出抑制内皮细胞生长的有效物质,并在该细胞上对有效物质的作用机制进行初步探讨。本论文以合欢皮乙醇回流-正丁醇萃取相(组分1)为原料,通过HP-20大孔树脂20%、70%乙醇梯度洗脱得到产物(组分2、3),通过Molish反应与Fehling反应对产物进行理化性质鉴定,反应结果显示组分1、2、3均为总苷类物质;溶血反应检测苷物质类别,结果显示组分1、3为皂苷类物质,再将总苷类物质进行酸水解反应得到相应的苷元物质(组分4、5、6),将上述6组分以HMEC-1进行活性筛选,同时测定细胞培养基上层中LDH的活力,对药物的毒性作用进行评价,结果为组分1在HMEC-1上IC50为3.49±0.03μg/mL,在12.5μg/mL时无细胞毒作用,组分3的IC50为2.17±0.13μg/mL,在5μg/mL时无细胞毒作用。用EGF诱导体外HMEC-1生长,发现2个组分均能抑制由EGF诱导的HMEC-1生长,也均能抑制由EGF诱导的HMEC-1细胞迁移与成管,且具有剂量依赖性;Westernblot检测信号通路PI3K/AKT与Ras/Raf/MEK/ERK中p-Akt与p-Erk1/2蛋白的表达,结果显示组分1、3均抑制了p-Akt的表达,且具有剂量依赖性;同时组分1在5μg/mL,组分3在2.5μg/mL下对p-Erk1/2的表达也有很强的抑制作用。并且发现,口服有效物质也具有良好效果。用台盼蓝染色法与Hoechst33342对细胞进行了坏死与凋亡检测,结果发现组分1在5μg/mL,组分3在2.5μg/mL下不会造成细胞坏死;流式细胞仪检测有效组分对细胞周期变化无明显的影响,对细胞凋亡有明显的作用;Western blot检测细胞中凋亡蛋白Caspase-3的变化,发现随着组分浓度的增加,Caspase-3蛋白被激活,进一步说明了有效组分对HMEC-1细胞的促凋亡作用,且在相同浓度下,组分3作用强于组分1。
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