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复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指临床上连续2次或2次以上的孕20W前或胎儿体重不足500g的妊娠丢失,临床上仍有50%～60%的RSA找不到明确的病因,称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。目前,关于URSA的具体发病机制仍不明确。近年来,表观遗传学及其相关研究已成为生命科学的前沿领域,作为表观调控的一个重要组成部分,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)具有重要的生物学功能。研究表明,lncRNA参与了 X染色体失活、基因印记、HOX基因簇调控等,在胚胎发育进程中扮演了极为重要的角色。其中,有些lncRNA可以转录自基因组上的增强子(enhancer)元件,这类lncRNA被称为增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)。尽管已经有一些研究证实了 eRNA对胚胎发育具有重要的调控作用,但目前尚未见关于eRNA在URSA中作用的相关报道。因此通过体外细胞实验或整体动物模型明确eRNA在URSA中的表达模式、表达调控机制和功能显得尤为迫切和重要。本研究拟基于不明原因复发性流产,针对绒毛组织,应用转录组测序及独立人群验证,筛选与URSA相关的eRNA,通过生物信息学分析、ChIP-qPCR等实验鉴定具有潜在功能的eRNA;并结合体外细胞实验,系统论证eRNA对胚胎发育的影响。第一部分不明原因复发性流产相关增强子RNA筛选及验证从增强子序列转录的RNA即为增强子RNA(eRNA)。目前尚未见关于eRNA在URSA中作用的相关报道,因此通过测序筛选与URSA相关的eRNA显得尤为重要。本部分研究拟采用高通量测序手段和生物信息学分析方法筛选与不明原因复发性流产相关的eRNA,采用qRT-PCR进行独立人群验证。通过RNA-seq,我们发现了13 1条在URSA和正常对照绒毛组织中有差异的lncRNA。通过与ENCODE及VISTA数据库中人胚胎干细胞组蛋白修饰的ChIP-Seq数据(已验证的增强子区域)进行比对,筛选出38条潜在功能性eRNA。对38条不明原因复发性流产相关的潜在功能性eRNA进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene Ontology)分析结果显示主要富集在炎症和感染相关通路,随后挑选了可能参与了炎症和感染相关通路的12条eRNA进行独立人群验证,结果有1 1条与测序结果一致,其中lnc-SLC4A1-l参与的炎症和感染相关通路数目最多,为后续研究提供了线索。第二部分增强子RNA lnc-Slc4a1-1在不明原因复发性流产中作用及机制研究妊娠是非常复杂的生命过程,母胎之间相互作用的平衡在维持正常妊娠过程中发挥重要作用。通过研究母胎界面滋养层细胞的功能变化,可探讨各种病理妊娠的发生机制。鉴于第一部分研究结果,本部分研究拟建立lnc-SLC4A1-1过表达的人滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞系,通过CCK-8、Transewell小室、流式细胞术等检测细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡、细胞周期等,观察过表达lnc-SLC4A1-l对滋养层细胞功能的影响。通过细胞测序检测过表达lnc-SLC4A1-1后下游靶基因变化情况,初步探索过表达lnc-SLC4A1-1在URSA中的作用。结果显示,lnc-slc4a1-1对滋养层细胞的增殖、迁移、周期和凋亡均有一定影响,这表明lnc-slc4a1-1在调节滋养层功能中的作用;通过ChIP-qPCR确认lnc-slc4a1-1是一条增强子RNA,过表达lnc-SLC4A1-1会导致TLR4表达上调,TNF-α、IL-1β浓度上升;使用TLR4拮抗剂后,结果发现与单纯过表达lnc-SLC4A1-1相比,细胞上清TNF-α浓度没有统计学差异(P>0.05),但出现降低趋势,IL-1β浓度降低(P<0.05)。因此lnc-SLC4A1-1可能通过招募H3K27ac调控TLR4表达,进而激活Toll样受体信号通路,TLR4活化后会激活下游信号分子TNF-α、IL-1β,引起炎症反应,失去Th2优势,最终导致URSA的发生。