论文部分内容阅读
脂肪酶(Lipase,E C 3.1.1.3)是一种特殊的酯键水解酶,能够催化甘油酯发生水解反应产生甘油和长链脂肪酸。脂肪酶也是一种具有界面催化特性的水解酶,能催化底物发生水解、酯交换、酯合成等反应。动物体内、植物种子和微生物中都广泛存在着各种的脂肪酶,其中种类最多的是来源于微生物的脂肪酶。微生物脂肪酶已被经广泛的应用于食品加工、洗涤剂生产、生物柴油、药物合成、废纸脱墨、制革、饲料生产等多个行业。本试验从牦牛瘤胃内容物中分离筛选产脂肪酶的微生物,以橄榄油为唯一碳源,通过中性红油脂平板初选和改进铜皂-分光光度计法测定酶活力复筛,筛选出TZ-2、TZ-4、TZ-6、TZ-7、TZ-8和TZ-9共6株产脂肪酶微生物,酶活力分别为3.30、2.96、5.48、3.12和4.40 U/mL。经形态学观察和生理生化反应,发现TZ-2、TZ-4和TZ-6为细菌,TZ-7、TZ-8和TZ-9为真菌。细菌菌株扩增16S r DNA序列,真菌菌株扩增ITS或18S rDNA序列,在NCBI上进行BLAST比对和构建进化树,确定TZ-2、TZ-4和TZ-6为液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens),TZ-8和TZ-9为白地霉(Geotrichum candidum),TZ-7为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。根据NCBI上的液化沙雷氏菌脂肪酶基因(gb:EF202840.1)设计引物,以液化沙雷氏菌的基因组DNA模板,PCR扩增目的基因后,以pMD19-T为载体,构建重组质粒pMD19T-SLL,导入E.coli DH5α细胞,筛选阳性克隆,进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和序列测定。结果显示,该基因全长为1848bp,与已知的液化沙雷氏菌脂肪酶基因(gb:EF202840.1)相似性达100%。将测序正确的液化沙雷氏菌脂肪酶基因和pET-28a载体用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切,构建重组表达质粒pET-28a-SLL,转化BL21细胞,用终浓度0.8mmol/L的IPTG诱导表达。经SDS-PAGE凝胶电泳检测表明,表达蛋白相对分子质量约为66.4ku,与液化沙雷氏菌脂肪酶大小相近。采用生物信息学方法,预测液化沙雷氏菌脂肪酶结构。结果显示,液化沙雷氏菌脂肪酶由615个氨基酸组成,相对分子质量为64938.9u,理论等电点为4.31,是一种亲水性的蛋白质,含有一个卷曲螺旋结构,无信号肽和跨膜区域,α螺旋含量为26.34%,β转角含量为12.52%,氨基酸序列的201~210位的ITISGHSLGG是保守区域,而该区域中的保守序列GHSLG与大部分脂肪酶活性中心的保守序列完全一致。