阿尔兹海默病(Alzheimer’ s disease,AD),又名早老性痴呆,是一种以记忆力损伤及进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性病变,为痴呆的主要类型之一.据世界卫生组织(WHO)统计,在2010年全球痴呆人数已达到3560万人,每年新发病例约770万人,几乎每4秒就会有一位新发痴呆病例,这意味着每20年全球痴呆人数即增加一倍,而阿尔兹海默病占全球痴呆比例为60-70%,是最常见的痴呆类型。65岁左右老年人约5%患有AD,而随着老年人的年龄的增加,发病比例明显增加,85岁左右的老年人每3-4位就有一位罹患AD。由于其病程的进行性及不可逆性,严重影响患者老年身心健康及生活质量,并为其家人及社会带来了严重的心理负担和经济负担,成为继肿瘤、心脑血管疾病之后,老年人健康的又一大杀手。阿尔兹海默病的主要特征性病理改变为大脑皮层及海马区神经元的丢失,其神经元细胞体外多聚A β多肽的斑块沉积及胞体内高度磷酸化的tau蛋白纤维缠结。其中目前研究认为分泌到细胞外的高浓度的寡聚Aβ多肽是造成突触传递信号功能障碍及神经元死亡的重要原因之一,而其作用机制尚不完全清楚,因此探寻A β的神经毒性的作用机制及影响因素是寻找有效治疗AD方法的必不可缺的前提基础。第一部分β-arrestin1/2影响A β 25-35的神经毒性阿尔兹海默病神经细胞体外的Aβ斑块沉积的组成部分主要是Aβ多肽片段,该多肽由39-43个氨基酸残基组成,是由Aβ前体蛋白(APP)经β-分泌酶及γ-分泌酶在胞膜处异常剪切导致,主要形式为Aβ1-40及Aβ1-42,目前已证实其中具有神经毒性是Aβ25-35片段,相同浓度的体外合成的Aβ25-35片段与体内存在形式的Aβ具有同等的神经元毒性,而其他缺少这部分的其他短肽及方向相反的Aβ35-25片段则不具有同等的神经元毒性,因此我们有理由相信阿尔兹海默病人体内的Aβ片段因包含这段序列而具有神经毒性。因此这Aβ 25-35片段如何产生神经元毒性及如何降低其毒性已成为研究AD发生发展机制及治疗措施的必经之路。Arrestins为细胞内高度保守的一类调节蛋白,是一个只有四种蛋白的小家族蛋白,分别为 arrestin1(visual arrestin),arrestin2(β-arrstin1),arrestin3(β-arrestin2),和 arrestin4(rodarrestin),是参与 G 蛋白偶联受体(GPCR)的信号转导过程中的重要蛋白,具有多种不同的功能。目前研究表明arrestin1和arrestin4主要存在于视网膜的视锥细胞和视杆细胞内,通过脱敏视蛋白来调节视网膜的感光。而β-arrstin1和β-arrstin2则普遍存在,不仅调节G蛋白偶联受体的脱敏、内化、再循环及降解过程,而且参与细胞的发育、移动及细胞核的功能。在研究AD中A β产生的影响因素时,发现β-arrstin1和β-arrstin2均可通过影响γ-分泌酶影响Aβ的产生;而β-arrstin1和β-arrstin2对Aβ的神经毒性的影响尚不清楚。因此,我们研究了 AD病人血样及不同AD细胞模型中β-arrestins的表达,并研究了 β-arrestins对Aβ损伤神经细胞过程中起到的作用,取得了如下研究成果:一、寡聚Aβ2-35具有神经毒性,可诱导细胞产生内质网应激继而发生细胞凋亡。1寡聚Aβ25-35显著降低神经源性细胞的存活率。细胞MTT实验表明寡聚Aβ25-35对人源神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、大鼠源嗜铬细胞瘤细胞株PC12均具有显著的神经毒性,且呈剂量、时间依赖性。其半数致死率分别为16.02 μM、24.53μM。2寡聚Aβ 25-35可以诱导SH-SY5Y细胞和PC12细胞产生内质网应激。寡聚Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞和PC12细胞后,导致蛋白在内质网中堆积,ERtracker的激光共聚焦结果显示20 μ M寡聚A β 25-35可在处理8h后引起内质网发生肿胀,甚至出现空泡化;Western blotting结果表明,Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞,在1h时eIF2 a磷酸化水平升高,4h时,eIF2a磷酸化水平降低,内质网伴侣蛋白GRP78表达开始上调;上述结果表明,Aβ25-35会导致内质网出现未折叠或错误折叠的蛋白累积,并呈时间依赖性诱导内质网应激。3寡聚A β 25-35诱导神经源性细胞凋亡。寡聚A β 25-35呈剂量时间依赖性诱导神经细胞凋亡。Western blotting结果表明,寡聚Aβ 25-35可通过激活caspase3,从而剪切其底物PARP,进而诱导凋亡。二、β-arrestins在AD病人血样及AD细胞模型中的表达异于正常对照组血样及对照组细胞模型。1 ARRB1和ARRB2在AD病人血样中表达低于正常老年人对照组血样。我们通过实时定量PCR分析两种样本血样中基因ARRB1和ARRB2的转录水平差异,研究ARRB1/2在正常老年人与AD病人的表达,结果示,在与正常老年人组比较,AD病人组样本血样中ARRB1和ARRB2的转录水平显著下降。该结果表明病人血样中,ARRB1/2基因的转录水平受到抑制,且ARRB1基因表达显著低于ARRB2。2稳定表达APP的HEK293(20E2)与转染空载质粒的HEK293细胞相比,后-arrestin1和β-arrestin2蛋白水平显著降低。western blotting结果表明与HEK293细胞相比,20E2细胞的β-arrestin1/2的蛋白水平均显著降低,其下游蛋白ERK的磷酸化水平降低。上述结果表明内源性A β影响β-arrestin1/2的表达水平。3外源性Aβ 25-35处理的神经细胞,β-arrestin1和β-arrestin2表达具有时间依赖性。我们以人源性SH-SY5Y细胞为神经细胞模型,加入Aβ25-35处理细胞。Western blotting时相结果分析显示,A β25-35处理后,β-arrestin1和β-arrestin2在Aβ 25-35处理1h表达上调,4h表达下调,并持续下降到16h。其下游蛋白ERK及AKT的磷酸化蛋白的水平与β-arrestin1/2的水平保持一致。该结果表明外源性A β 25-35影响β-arrestin1及β-arrestin2的表达,且具有时间依赖性。三、ARRB1对Aβ的神经毒性的影响异于ARRB2的影响。1人源性神经细胞SH-SY5Y中,ARRB1干扰后,Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞的存活率显著降低,而干扰ARRB2的SH-SY5Y细胞在A β 25-35处理后的存活率明显升高。细胞增殖实验MTT结果表明,干扰ARRB1的SH-SY5Y细胞不仅自身的增殖能力受到抑制,且加入Aβ25-35后,细胞存活能力较阴性干扰Aβ25-35处理组显著降低。而干扰ARRB2后,MTT结果显示,ARRB2干扰后,SH-SY5Y细胞的自身增殖水平未见明显变化,而干扰ARRB2的SH-SY5Y细胞在Aβ25-35处理后的存活率则较阴性干扰A β 25-35处理组明显升高。以上结果表明β-arrestin 2在A β对细胞的神经毒性作用过程中与β-arrestin 1作用不同。2β-arrestin 1对SH-SY5Y细胞增殖相关信号具有抑制作用。Western blotting结果表明阴性干扰组细胞只在A β处理后出现ERK磷酸化水平、AKT磷酸化水平显著降低,且PARP出现剪切;干扰ARRB1的对照组细胞的ERK磷酸化水平、AKT磷酸化水平已经开始降低,且PARP出现剪切,而加入A β 25-35则增强这种变化趋势。该结果表明β-arrestin 1可以调节ERK、AKT的磷酸化水平。第二部分β-arrestin 1/2通过参与Aβ诱导自噬的形成及自噬泡的降解,影响Aβ的神经毒性自噬,作为细胞内一种高度保守的细胞调节机制,是降解细胞内无用的细胞器及错误折叠的或有害的大分子蛋白主要途径之一,研究表明,自噬主要可划分为两部分,首先,双层膜结构包裹待降解物质形成自噬泡,然后自噬泡与成熟溶酶体结合生成自噬溶酶体,待降解物质经溶酶体内的酸性酶溶解成小分子物质供应细胞利用,为细胞存活及代谢提供能量。现有研究已知自噬在神经退行性疾病的发生发展中起到重要作用,已知ARRB1/2在阿尔兹海默病中除了可以影响Aβ单体的生成,其他影响及机制尚不明确,而已有研究表明β-arrestin 1在小鼠大脑中通过与beclin1等自噬相关蛋白形成复合体参与饥饿诱导的自噬泡的形成,影响脑缺血后神经细胞的存活,那么研究β-arrestin 1/2是否在阿尔兹海默病(AD)中通过参与自噬中起作用则为研究治疗AD提供了靶点。因此我们Aβ25-35诱导的自噬及β-arrestin 1/2自噬中是否具有作用进行了研究。得到如下研究成果。一、Aβ诱导神经细胞产生自噬1Aβ25-35诱导细胞产生自噬。Aβ处理30min-1h时,不仅诱导LC3Ⅰ表达升高,而且促进LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转变,LC3Ⅱ的表达升高提示A β 25-35可使细胞形成自噬泡。LC3免疫荧光结果同样证明Aβ25-35作用SH-SY5Y细胞1h产生自噬,作用8h时,自噬降低。LC3双荧光病毒转染的激光共聚焦结果明确显示,Aβ25-35作用1h显著诱导神经源性细胞SH-SY5Y的LC3聚集,绿色及黄色的荧光斑点的产生,标志着自噬泡和自噬溶酶体明显增多,提示自噬流的增加,Aβ 25-35作用4h-8h,黄色荧光减少,大部分荧光点为红色,且荧光强度降低。LAMβ1免疫荧光的共聚焦显微结果示,与阴性对照组相比,加入Aβ25-35后,LAMβ1在1h时表达增加,且呈点状聚集,该结果表明加入Aβ25-351h,细胞诱导产生自噬泡,而且出现自噬流的增加,可以部分缓解Aβ25-35的神经毒性,但随着A325-35作用时间的延长,自噬泡与溶酶体融合出现异常,阻断自噬流,促进细胞死亡。2.A β 25-35诱导SH-SY5Y的自噬为保护性自噬。利用siRNA特异性的降低LC3B或Beclinl的表达,可显著抑制LC3Ⅱ的表达抑制自噬泡的形成,加速细胞死亡,显著增强Aβ25-35的细胞毒性。上述结果表明,下调自噬相关基因表达加速Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞死亡,A β 25-35诱导SH-SY5Y的自噬为保护性自噬。3.Aβ 25-35诱导的PC12的自噬为损伤性自噬。利用自噬抑制剂3-MA阻断自噬,与单加寡聚A β 25-35组相比,3-MA与寡聚A β 25-35联用组的细胞存活率明显增加,表明对于PC12细胞,抑制自噬会降低寡聚Aβ25-35的细胞毒性。上述结果表明,抑制自噬缓解Aβ诱导的PC12细胞死亡,Aβ 25-35诱导的PC12的自噬为损伤性自噬。4 SH-SY5Y细胞与PC12细胞基础自噬水平不同。根据Western blotting实验结果分析,SH-SY5Y细胞的LC3Ⅰ表达量明显低于PC12细胞,同时SH-SY5Y细胞的LC3Ⅱ表达量同样低于PC12细胞,该结果表明SH-SY5Y细胞基础自噬水平显著低于PC 12细胞的基础自噬水平。二、β-arrestin1参与A β 25-35诱导自噬的形成1.AD细胞模型中β-arrestins表达水平与LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 一致。内源性A β的AD细胞模型中,与HEK293细胞相比,HEK293-APPwt细胞的LC3Ⅰ的蛋白水平显著增加,但LC3Ⅱ的蛋白水平相对较低,即LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转变水平相对降低,说明HEK293-APPwt细胞的自噬泡形成水平比HEK293低,与该细胞的β-arrestin1/2的水平保持一致。外源性加入Aβ25-35的SH-SY5Y细胞中,β-arrestin1/2的表达与LC3Ⅱ的蛋白表达同样在1h时增加,4h时出现下调并持续到16h,表达趋势一致。该结果表明AD的SH-SY5Y细胞模型中β-arrestin1/2与自噬泡形成相关。2.干扰ARRB1降低Aβ 25-35相关的细胞自噬水平。Western blotting结果表明,加入A β 25-351h后,在干扰对照组表达增多的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、beclin1、ATG7,在干扰β-arrestin1组出现表达幅度的降低,该结果说明干扰β-arrestin1可有效的抑制自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ转换并降低beclin1、ATG7进一步合成进而抑制自噬诱导;LC3B免疫荧光共聚焦结果示,干扰对照组中,加入Aβ25-35 1h,LC3B的表达增高,并在细胞内形成点状聚集,自噬泡增多,在8h时降低,点状聚集消失说明此时自噬泡形成减少;ARRB1干扰组中,加入Aβ25-35后,LC3B的表达虽有升高,但显著低于阴性对照组,且没有形成点状聚集,说明干扰ARRB1基因后,虽然细胞内LC3B的合成增加,但不能参与形成自噬体,即Aβ25-35处理1h时,干扰组中细胞自噬水平与对照组相比较低,即β-arrestin1的低表达影响了自噬泡的形成。3.干扰ARRB2不影响Aβ25-35相关的细胞自噬水平。Western blotting结果示,干扰ARRB2后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ、beclin1、ATG7的基础水平无明显降低,加入A β 25-35 1h后,干扰ARRB2的SH-SY5Y细胞的LC3B表达与对照组无明显差异;该结果表明下调β-arrestin2不影响自噬泡的形成。三、β-arrestins不参与损伤溶酶体影响A β 25-35神经毒性。1 Aβ25-35损伤细胞的溶酶体。用lysosomal tracker red染SH-SY5Y细胞质中的溶酶体,共聚焦显微镜拍照结果示,阴性对照组细胞中,溶酶体被染成红色点状,均匀分布在胞质中,Aβ25-35处理组,红色点状的溶酶体数量上减少,单个溶酶体染色变浅,且具有时间依赖性。该结果表明Aβ 25-35抑制细胞内溶酶体的正常功能。2 β-arrestins不能通过影响细胞内溶酶体缓解Aβ25-35毒性。lysosomal tracker red染色溶酶体,共聚焦显微拍照结果示,无Aβ25-35处理组细胞,干扰ARRB1组细胞胞质中红色点状的溶酶体与阴性组细胞质中相比轻度减少,Aβ25-35处理组中,阴性干扰组与ARRβ1干扰组的红色点状溶酶体数量上基本不变,单个溶酶体染色深浅无差异。第三部分β-arrestins通过参与神经元细胞膜表面的α 7nAchR表达,影响Aβ25-35的神经毒性乙酰胆碱受体为人体内重要的受体之一,主要分为M型及N型,其配体为乙酰胆碱,其中烟碱型乙酰胆碱受体是配体门控的离子通道受体,主要分布在大脑的突触后膜上,神经元通过释放乙酰胆碱,将神经元的电信号转换成化学信号,乙酰胆碱与突触后膜的乙酰胆碱受体结合,再次将化学信号转换成电信号,继续神经元之间的信息传导。其中α 7nAchR是其中一个亚型,由五个α 7亚基组成,研究发现,α 7nAchR对神经元的信号传递和保护具有重要作用。尤其在AD中,α7nAchR对AD病人记忆及认知起重要作用,也是AD发展过程中较早出现异常减少的受体,目前AD的主要治疗药物之一,例如多奈哌齐,就是通过增加α7nAchR配体的数量进而增强α 7nAchR的活性,但当α 7nAchR在突触后膜的数量逐渐降低时,该类药物对AD病人的治疗效果也会逐渐降低,因此,增强突触膜表面的α 7nAchR数量成为解决AD病人治疗的关键问题。而目前尚无研究可以通过有效增强α 7nAchR的表达缓解AD进展。因此,研究α 7nAchR在神经细胞膜表面的表达及其影响因素,是寻找AD有效治疗方法的主要策略之一。一、α 7nAchR对神经细胞具有保护作用。1.α 7nAchR在AD病人血样中的表达低于正常对照组血样。我们通过实时定量PCR分析两种样本血样中基因CHRNA7的转录水平差异,研究α 7nAchR在正常老年人与AD病人的表达,结果示,在与正常老年人组比较,AD病人组样本血样中αCHRNA7的转录水平显著下降。该结果表明病人血样中,CHRNA7基因的转录水平受到抑制。2.α 7nAchR激动剂尼古丁具有神经细胞保护作用,干扰α 7nAchR后会抑制细胞活性并显著降低尼古丁的保护作用。细胞MTT实验结果分析,提前加入尼古丁可以活化α7nAchR,部分逆转Aβ 25-35的神经毒性,增加细胞的存活率。干扰α7nAchR不仅抑制细胞的增殖能力,而且增强A β 25-35的神经毒性,干扰α 7nAchR后,尼古丁不能增加Aβ 25-35处理组细胞的存活率。上述实验结果表明,Aβ25-35存在时,α7nAchR,可以对细胞起保护作用,尼古丁可以通过活化α7nAchR增强该保护作用。减少膜表面的α 7nAchR,不但会使尼古丁保护作用失效,而且会增强Aβ 25-35的神经毒性。二、下调β-arrestin2增强尼古丁对神经细胞的保护作用。1.下调β-arrestin1对尼古丁的神经细胞保护作用无影响。根据细胞MTT实验结果,阴性干扰组中预先加入尼古丁可以降低Aβ25-35的细胞毒性,增加SH-SY5Y细胞的存活率,干扰ARRB1组SH-SY5Y细胞经A β 25-35处理后,细胞死亡率增加,而尼古丁处理组与尼古丁非处理组相比,不能提高神经细胞的存活率。该结果说明下调β-arrestin1可以增加Aβ25-35的毒性,且不能通过尼古丁影响Aβ2.5-35的神经毒性作用。2.下调β-arrestin2增强尼古丁对神经细胞的保护作用。细胞MTT实验结果分析,阴性干扰组中预先加入尼古丁可以降低Aβ25-35的细胞毒性,增加SH-SY5Y细胞的存活率,干扰ARRB2组细胞经Aβ25-35处理后,SH-SY5Y细胞死亡率与阴性干扰组细胞相比显著减少,其中尼古丁处理组与尼古丁非处理组相比,神经细胞的存活率显著增加。该结果说明下调β-arrestin2可以通过增强尼古丁的神经保护作用缓解Aβ 25-35的毒性。三、β-arrestin2参与细胞膜表面的α7nAchR表达1.流式细胞术结果表明,SH-SY5Y细胞在A β 25-35处理后,存活的SH-SY5Y细胞膜表面的α7nAchR有轻度增加。该结果表明细胞膜表面的α7nAchR的数量受外界因素影响出现变化,比如Aβ25-35。2.下调β-arrestin1轻度升高基础水平的α7nAchR。流式细胞术结果分析,与阴性干扰组相比,下调β-arrestin1可以轻度增加细胞膜表面的a 7nAchR数量。该结果表明下调β-arrestin1可以轻度增加细胞膜表面的α 7nAchR的数量。3.干扰β-arrestin2显著升高基础水平的α7nAchR。流式细胞术结果分析,下调β-arrestin2可以显著增加细胞膜表面的α 7nAchR数量。该结果表明单独干扰β-arrestin2的表达可以显著增加细胞膜表面α 7nAchR的数量。第四部分结论及创新点结论1.β-arrestin1/2在正常老年人与同年龄段阿尔兹海默病病人体内中表达具有差异,为研究AD发生发展及治疗方法的切入靶点。2.β-arrestin1低表达时增加Aβ 25-35对SH-SY5Y细胞的神经毒性,β-arrestin2低表达时减缓A β 25-35对SH-SY5Y细胞的神经毒性。3.β-arrestin1参与A β诱导的自噬。4.β-arrestin2低表达通过上调SH-SY5Y细胞膜表面α 7nAchR表达保护神经细胞。创新点与不足之处1.首次报道β-arrestins在Aβ 25-35诱导的细胞死亡中的作用。阿尔兹海默病进展的主要原因之一就是神经元细胞的死亡,因此,寻找神经元细胞死亡的影响基因,并及时加以干预,缓解神经元细胞的死亡是目前很有价值的治疗方向之一。2.首次报道β-arrestin1通过参与Aβ25-35诱导的自噬影响神经细胞的存活。但β-arrestins如何参与自噬需要进一步研究。3.首次报道β-arrestins通过影响细胞膜表面α7nAchR表达影响神经细胞存活。α 7nAchR数量及活性的降低使神经细胞死亡增加,是阿尔兹海默病人出现认知障碍及记忆力下降的主要原因之一,而且增加α 7nAchR活性是目前治疗阿尔兹海默病的靶点之一,例如多奈哌齐,一种缓解早中期阿尔兹海默病人记忆力下降的有效药物,因此研究有效提高细胞膜表面α 7nAchR的数量是目前前景良好的治疗方向之一,但β-arrestins参与细胞膜表面α 7nAchR表达的具体机制需要进一步研究。