本文为建立运动马尿液和血液中咖啡因含量的气相色谱-质谱联用检测方法。比较了液液萃取、固相萃取、QuEChERS法样品前处理方法的优缺点,并从萃取溶剂、萃取pH值、萃取体积及次数等方面对液液萃取法进行了优化。比较了吲哚、氘代咖啡因、13C咖啡因等内标化合物。比较了全扫描模式和选择离子扫描模式,及丙酮、甲醇、正己烷三种进样溶剂对于电子轰击离子源咖啡因离子化的影响。比较了不同保存条件对于标准工作液（包括内标物）、标准阳性样品中咖啡因浓度的影响。实验结果证明,待测样品3mL加入300μL内标物（13C咖啡因）,尿样调节pH至8.1（血样加300μL三氯乙酸离心,取上清液调节pH至10.0）,以2mL氯仿萃取三次合并萃取液以氮气吹干,200μL甲醇定容过滤上机测定（1.0μL进样）。色谱条件（hp-5ms,30m×0.25mm×0.25μm）由 80℃至 280℃程序升温,高纯度氦气 1.2mL·min-1洗脱质谱。194（197内标物）,109,82,67 m/z定性,以194/197峰面积比定量。本方法咖啡因分别在80ng.mL^-1～140ng·mL^-1（尿样）,60ng·mL^-1～120ng.mL^-1（血样）浓度范围内有良好的线性关系,r2>0.9999（尿样）、r2>0.998（血样）,其中检测限为尿液样30ng·mL^-1,血清样20ng·mL^-1定量限为尿液80ng·mL^-1,血清样60ng·mL^-1。绝对回收率在82%～97%;相对回收率在96%～101%范围,日内、日间精密度RSD值在0.36%～5.71%范围内。经NIST谱库检索及文献调查,尚未发现194,109,82,67 m/z四个特征碎片的干扰化合物,同时满足保留时间佐证。该方法提取率高,精密度好,灵敏度高,定量定性准确,专属性和适用性强。