研究背景近年来口腔种植成为越来越多患者修复治疗的首选方案。种植修复是通过种植体与植入区牙槽骨之间形成“骨整合”而获得固位力。种植区骨量不足,不仅会降低种植的成功率,还会影响修复后的美学效果。如何更好的促进骨组织再生增加种植区骨量是口腔种植学近年的研究热点。通过生物化学的方法在骨代用品中添加具有成骨诱导能力的生物活性分子是一种有效的促进骨再生的方式。近期研究发现20(S)-羟基胆固醇(20(S)-OXY)能诱导间充质干细胞成骨分化,同时还抑制其成脂分化。但20(S)-OXY存在一些不足,首先其疏水性不利于附着在亲水性材料表面,其次20(S)-OXY体内半衰期短,极易被肝脏代谢。目前相关研究方向集中在改变20(S)-OXY化学结构以提高其成骨能力,尚无采用药物释放系统对20(S)-OXY进行包载,并观察此载药系统体内、外成骨效能的实验。研究目的研究载20(S)-羟基胆固醇mPEG-PLA聚合物胶束(20(S)-hydroxycholesterol loaded mPEG-PLA polymeric micelles,20(S)-OXY-PM)的制备工艺及该载药剂型的体外缓释效果;探讨20(S)-OXY-PM体外诱导成骨和体内促进成骨的效果及其可能的机制。研究方法1.采用纳米沉淀法以两亲性嵌段聚合物mPEG-PLA为载体制备20(S)-OXY-PM。通过单因素实验确定出适合本实验研究的合成条件。采用动态光散射仪、透射电镜、高效液相色谱表征20(S)-OXY-PM物理特性,检测其缓释能力。2.以小鼠骨髓间充质干细胞系M2-10B4为细胞实验模型,通过MTS细胞活力测定、碱性磷酸酶(ALP)染色及活性比色测定、倒置相差显微镜观察、茜素红染色、qRT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot等方法分别检测20(S)-OXY-PM对细胞增殖、ALP活性、细胞分化形态、矿化沉积能力、成骨相关基因、蛋白表达的影响。通过使用Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺,采用Western blot检测Gli1表达,以初探20(S)-OXY-PM对Hedgehog信号通路的影响。3.以兔颅骨标准骨缺损为动物实验模型,术后愈合3周、6周,利用Micro-CT三维重建骨缺损区并测量新成骨骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV),荧光染色标记新成骨,甲苯胺蓝组织形态学观察骨缺损区新骨生成情况并测量新成骨面积。结果1.通过单因素实验确定适合本实验的合成条件为:有机溶剂采用DMSO,有机相与水混合转速为500rpm,初始投药量为药物与载体质量比2:10。DLS检测胶束粒子平均粒径为58.94nm,多分散系数0.11,Zeta电势-9.95mV。TEM观察载药胶束粒子近似球形。采用此方法合成的载药胶束载药量为10.79%,包封率为60.46%,体外缓释时间达120小时,释放较缓慢。2.MTS检测结果显示空胶束对细胞增殖没有明显影响,20(S)-OXY会降低细胞增殖能力,呈现出剂量依赖性。ALP检测及茜素红染色结果显示相同浓度时,20(S)-OXY-PM组较20(S)-OXY组ALP活性、细胞的矿化能力提高,且高浓度20(S)-OXY-PM组效果最为明显。倒置相差显微镜记录结果可见,相同浓度时,间充质干细胞向成骨细胞形态转变20(S)-OXY-PM组较20(S)-OXY组明显,药物浓度高细胞形态变化更大。高浓度20(S)-OXY-PM组和20(S)-OXY组明显上调成骨分化相关基因Runx2、OSX、ALP、OCN表达,且20(S)-OXY-PM组上调更显著。免疫荧光及Western blot检测结果显示20(S)-OXY-PM组较20(S)-OXY组OCN分泌增多,高浓度20(S)-OXY-PM组更明显。Western blot检测Gli1表达发现20(S)-OXY-PM组高于20(S)-OXY组,加入环巴胺会抑制两组上调Gli1表达的效果。3.Micro-CT结果显示3周和6周时,20(S)-OXY-PM组和20(S)-OXY组的BV/TV及BMD均增多,20(S)-OXY-PM组增多更为明显。三维重建可见6周时,仅20(S)-OXY-PM组骨缺损基本被新骨填满。三维重建及荧光染色切片观察可见20(S)-OXY-PM组骨缺损中心出现了与骨创周围新生骨分离的椭圆形同心圆状荧光团,说明20(S)-OXY-PM原位成骨激活的能力更强。甲苯胺蓝染色的新成骨形态与荧光染色结果一致,新成骨面积计量分析结果与Micro-CT测量的BV/TV相似。结论1.可采用纳米沉淀法制备20(S)-OXY-PM,此载药剂型可以明显的延长20(S)-OXY的释放时间。2.体外细胞实验证明,20(S)-OXY经mPEG-PLA纳米胶束包载后成骨诱导能力提高。3.兔颅骨缺损后骨再生实验证实20(S)-OXY-PM原位骨激活能力较20(S)-OXY强,能更好促进新骨形成。