目的：肝癌是我国高发的主要恶性肿瘤之一，严重影响着我国人民的健康，同时我国也是世界上高感染率／携带者国家之一。对高危人群进行监测和早期诊断在很大程度上能改善肝癌的治疗和预后，近年来血浆循环核酸的研究表明利用分子生物学手段检测循环血清／血浆核酸可为恶性疾病的诊断提供一些有益的帮助，并可望成为一种非侵入性、简单经济的方法。本研究初步探讨并建立了血浆循环核酸中某些基因突变研究简便快捷的方法，通过分析肝脏良恶性疾病患者血浆循环核酸p53基因突变及其特征和规律，结合患者的病理和临床资料初步探讨了循环核酸突变检测对肝癌预防、诊断和预后估计的可行性和临床价值。 方法：选取肝脏疾病患者共61例，其中原发性肝癌36例，来自2000-07／2001-09月我科住院患者，全部经手术后／肝脏穿刺病理确 第＠罗僵上学嚷亡晕佐抢支 诊为原发性肝癌，其中 1期0例，11期4例，Ill期门例，f期 15例， HBsAs＋20例；男23例，女13例，年龄27～82（平均45．3）岁。对照 组为乙型肝炎肝硬化患者（ZI例），肝血管瘤（2例）和肝囊肿（2例） 共25例，并同时采用25例健康献血员血浆作为正常对照。肝癌患者‘同时采集其病理资料和肿瘤标志物的化验结果：对其中完全缓解的2 例肝癌患者和其它5例不同类型肿瘤（淋巴瘤2例，小细胞肺癌2例， 滑膜肉瘤l例）的完全缓解患者进行了循环核酸的多次监测。采集的 血浆分别通过Qiagen微量离心柱抽提法提取循环核酸（DNA），应用 聚合酶链反应（PCR）扩增P53基因突变高发区的外显于5＆6，7和8 （E5＆6，E7和ES），利用变性高效液相色谱法（DHPLC）对PCR产物进 行定性定量分析和突变筛选，最终通过Sanger双脱氧法以及直接测 序进行验证和检测突变类型，并结合临床资料分析结果。数据分析 采用SPSS for。indo。s 10．0进行检验或方差分析。 结果：36例恶性肿瘤患者血浆提取的DNA扩增出E5＆6，E7和ES分别 为10、36、35例，对照组对应为0、6、4例，正常对照献血员组血浆 无一例扩增出目的片断。DHPLC产物大小分析表明扩增产物的大小和 特异性均较好，定量分析结果显示外显子5＆6的扩增效率低于外显子 7，8，而外显子7、8间未见明显差异。36例原发性肝癌DHPLC检测 到E5＆6突变者4例，E7突变 12例，外显子8未筛选到突变。对照组检 测到2例E7突变，突变者和无突变者进行测序结果证实与DHPLC筛选 结果一致，7例完全缓解患者有2例在无病生存2个月后的第四周期检 测中未能扩增到目的片断。 结论：实验初步的结果提示对恶性肿瘤患者循环核酸进行某些肿瘤 相关基因小片段的PCR扩增是完全可行的，DHPLC可作为一种简便快 －5－ ＄opT4k44t％fdkk 速的筛选方法。对照组和献血员组之间未见明显差异，而良恶性组 间对循环核酸扩增阳性率有明显差异（尸＜0．05）。这种差异对于恶 性疾病的诊断有一定的鉴别意义。结果表明在肝癌患者中循环核酸 P53基因突变多见于外显子7，也未见明显的突变集中点，这与以往 的研究发现的突变多集中于249和273位密码子的研究结果不同。本 研究通过DHPLC方法筛选发现外显子5＆6的突变率较低，外显于8 并非突变热点。突变的类型以碱基的替换为主，这与以前在肝癌组 织中得到的研究结论一致。P53基因突变与性别、肿瘤分期、肿瘤大 小和患者血清AFP值未见明显关系，而与肿瘤的病理学分级有明显的 相关性，即突变在一定程度上意味着细胞的低分化和不良的预后。 HBsAg＋肝癌患者053基因突变率明显高于HBsAg－肝癌患者（尸 ＜0．05），提示突变的发生与乙型肝炎感染有关。因此循环核酸基因 突变的检测有望成为乙型肝炎感染后肝癌的发生以及相关疾病的监 测和早期诊断新的手段。对于14例临床治疗效果不同的患者间， DHPLC定量的结果表明完全缓解组呈下降趋势，而进展组则不明显， 2例完全缓解患者的结果在无病生存两个月后扩增不到目的片断，提 示循环核酸水平的明显改变，也表明循环核酸的检测有望成为临床 疾病转归和预后的指标。