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青霉素酰化酶(Penicillin acylase,E.C.3.5.1.11以下简称PA)在工业上用于裂解青霉素为6-氨基青霉烷酸(6-APA)或半合成β-内酰胺抗生素的合成。其应用的形式有水相中固定化酶、膜反应器等,但酶在应用中存在的一个普遍问题就是由于底物或产物抑制,使得最终的产物得率降低,若在两相中进行酶的相转移催化,产物或底物能够及时转移,最终的产物得率必然会明显提高。本论文旨在研究探索适合于固定化的青霉素酰化酶(PA)进行相转移催化反应的两水相体系,通过合理的工艺设计,解除底物和产物抑制,并力图寻求可回收的两水相体系,寻找高效生物催化的反应体系,以实现其用于工业化生产。
为此本论文首先对PEG400-硫酸铵两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应体系进行了探索。从常规方法、Diamond-Hsu模型法等对体系进行了优化,同时对反应体系的底物加量、固定化酶加量等操作参数进行了优化,最后在这个两水相体系中,解决了6-APA小分子在两水相的分配差,底物与产物主要分配在上相,而固定化酶完全分配在下相,底物青霉素从上相扩散到下相经酶催化生成6-APA,产物被萃取到上相,解除6-APA、青霉素及苯乙酸等对酶活性的抑制。整个两水相反应体系中6-APA、青霉素及苯乙酸的分配系数分别为:5.0、3.4和1.8,酶催化反应中6-APA的产物摩尔得率在87-89%,两相总得率超过95%,较目前的商业方法得率提高了近10%,具有一定的推广意义。
其次本论文又对一种光敏感可再生高聚物(P<,NBC> 300000)与葡聚糖20000(Dextran20000)形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应体系进行了探索。在这个两水相体系中,通过优化,在50 mmol/LKC1存在下,6-APA的分配系数可达8.41。催化动力学显示,达平衡的时间近6h,反应最高得率约83%(pH 7.8,底物浓度62 mmol/L,20℃)。形成两水相的高聚物通过488 nm的激光照射可实现循环利用,高聚物的光照回收率在95%-98%之间。
最后,在全回收:P<,NBC>-P<,ADB>两水相体系中进行了固定化青素酰化酶的相转移催化青霉素G为6-APA反应的验证实验,6-APA在两相的分配系数可达5.8,转化率最高在85.3%,成相聚合物在反应后通过光照和调节pH实现回收,其回收率达到95-99%,为实现可回收利用的两水相体系奠定了应用基础。