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目的:应用三种长效酰胺类局麻药左旋布比卡因、罗哌卡因和布比卡因致大鼠中毒惊厥模型,给予静脉全麻药异丙酚抑制惊厥,观察海马c-fos、一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)的活性表达变化,比较异丙酚抑制这三种局麻药致惊厥的作用。
方法:
1实验分组及动物模型的制备
健康雄性Wistar大鼠64只,体重25±20g(河北医科大学实验动物中心提供)。随机分为对照组(C组),左旋布比卡因组(L组),罗哌卡因组(R组),布比卡因组(B组),四组再按同源配对设计分为实验组(EG)和异丙酚处理组(PG)两个亚组(n=8),共计8组。大鼠腹腔注射10％水合氯醛350mg/kg麻醉后,于尾静脉放置24号套管针,接肝素帽再贴好敷贴备用。24小时后,将连有延长管的注射器与大鼠(清醒)尾静脉留置针上的肝素帽相连,再将注射器连接微量注射泵,之后按照实验分组给予不同的处理:L组、R组和B组的实验组(EG)分别经尾静脉持续泵入0.75％左旋布比卡因、0.75％罗哌卡因以和0.75％布比卡因,速度均为2mg-kg-1·min-1,观察给局麻药后大鼠的临床表现,出现惊厥反应(全身不自主或不协调的抽搐)后立即停止泵入局麻药,持续泵入生理盐水。异丙酚处理组(PG)按照实验组泵入上述的局麻药,出现惊厥反应后立即停药,2mg/kg的剂量缓慢(15秒)静推异丙酚(用5％葡萄糖注射液稀释一倍),然后持续泵入生理盐水。C组的实验组(EG):生理盐水以3ml/h的速度经尾静脉持续泵入,异丙酚处理组(PG)泵入生理盐水的时间与预实验中求得的L组泵入左布比卡因时间的95％可信区间相当,再同上述异丙酚处理组,静推异丙酚。记录从给药到发生惊厥的时间。各组均给以面罩吸氧,出现呼吸抑制者给予辅助呼吸。
2标本的采集及检测方法
惊厥发生2小时后,在深麻醉下断头取脑,用滤纸吸去血液,剥离海马组织,取一侧的海马组织浸入4％多聚甲醛溶液中4℃保存备用。将另一侧的海马组织放在冷冻管中,冻存于液氮。
2.1海马CA1区c-fos表达的测定
取出浸入4％多聚甲醛溶液中保存的海马组织,之后酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,连续冠状切片(片厚4μm),EliVision puls免疫组化法染色。每组随机选择8张切片,每张切片在海马组织分别随机取5个高倍(10×40)视野,以胞核染成棕黄色作为阳性细胞,计数c-fos阳性细胞数。计算出各组的实验组和异丙酚处理组的差值D与实验组的比值K(K=D/EG)。
2.2海马一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合成酶(NOS)活性的测定
将保存于液氮的海马组织称重后,用冷生理盐水作匀浆介质,在盛有冰块的器皿中用玻璃匀浆器研磨成10％的组织均浆。4℃,3000r/min离心20min,取上清液。于-30℃以下低温保存待测。NO的测定采用硝酸还原酶法:NO与分子氧反应生成NO2-,并转化成NO3-和NO2-采用还原法使NO3-还原为NO2-,测定NO2-的量可作为NO生成的良好指标。NOS的测定是依据NOS催化L-精氨酸(L-Arg)生成NO,NO与二价铁配合物(呈色剂)形成有色物,测定其值即代表NOS活性.具体操作按试剂盒说明书进行。计算出各组的实验组和异丙酚处理组的差值D与实验组的比值K(K=D/EG)。
c-fos阳性细胞数,一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性分别计算出平均数和标准差,数据以-x±s表示,采用SPSS13.0软件进行方差分析及t检验,P＜0.05表示差异有显著性。
结果:
1各组间体重比较差异无统计学意义
2各组惊厥出现时间及异丙酚的抗惊厥作用
除C组外各组均见惊厥出现。各实验组从泵入局麻药到出现惊厥的时间(min)分别为,L组:10.63±4.809;R组:12.63±7.836;B组:7.75±3.919,惊厥持续约半分钟到一分钟,能自行停止,若惊厥致死则弃之。各异丙酚处理组在给予异丙酚后很快抑制惊厥(多在15秒内),如头面部及四肢抽搐甚至角弓反张消失,呼吸急促转为平稳而无呼吸抑制,整体处于安静状态,甚至有些大鼠在15秒静推异丙酚过程中即抑制惊厥,从整体表现以及时间观察,异丙酚抑制各组惊厥发生的表现没有明显的区别。
3海马CA1区c-fos表达的比较
与C组的实验组比较,L组、R组和B组的实验组海马CA1区c-fos阳性细胞数均显著增多,差异有显著性(P＜0.05)。在L组、R组和B组中,与对应的实验组比较,异丙酚处理组海马CA1区c-fos阳性细胞数均明显减少(P＜0.05),表明异丙酚均能抑制这三种局麻药致惊厥引起的c-fos增加;与B组c-fos阳性细胞数K值相比,L组与R组K值均明显减小(P＜0.05),L组与R组K值比较无统计学差异(P＞0.05)。
4海马NO含量的比较
与C组的实验组比较,L组、R组和B组的实验组海马NO含量均显著增多(P＜0.05)。在L组、R组和B组中,与对应的实验组比较,异丙酚处理组海马NO含量均明显降低(P＜0.05)。与B组NO含量K值相比,L组与R组K值均明显减小(P＜0.05),L组与R组K值比较无统计学差异(P＞0.05)。
5海马NOS活性表达的比较
与C组实验组比较,L组、R组和B组的实验组NOS活性表达均显著增多(P＜0.05)。在L组、R组和B组中,与对应的实验组比较,异丙酚处理组海马NOS活性表达明显减少(P＜0.05),与B组NOS活性K值相比,L组与R组K值均明显减小,L组与R组K值比较无统计学差异(P＞0.05)。
结论:异丙酚均能够在一定程度上抑制左旋布比卡因、罗哌卡因和布比卡因引起的惊厥。从c-fos、NO和NOS活性变化观察,异丙酚抑制布比卡因致惊厥的作用强于抑制左旋布比卡因和罗哌卡因致惊厥的作用。