论文部分内容阅读
背景： 糖原累积病IX型（Glycogen storage disease type IX,GSD IX）是磷酸化酶激酶缺陷导致的一组遗传代谢疾病,是糖原累积病的常见类型。磷酸化酶激酶（Phosphorylase kinase,PhK）是由四个亚基α、β、γ和δ组成的全酶(αβγδ)4，是调节糖原分解和代谢的关键酶。GSD IX根据临床和遗传的异质性分为四个亚型：IXa、IXb、IXc和IXd。 GSD IXc型（OMIM613027）是PHKG2（OMIM172471）基因突变导致肝脏PhK的γ亚基缺陷的常染色体隐性遗传病，是GSD IX型中的罕见类型。一般婴幼儿期起病，表现为肝大、生长迟缓，肝酶升高、空腹低血糖、高乳酸血症、代谢性酸中毒、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，肝纤维化和肝硬化风险较高。目前GSD IXc型患儿治疗主要是饮食治疗和对症处理，包括口服生玉米淀粉（uncooked cornstarch,UCCS)，定期监测血糖。 PHKG2基因位于染色体16p11.2，含10个外显子，全长9.5kb，编码406个氨基酸。在HGMD数据库及文献中已报道31种突变，未见突变热点。 GSD IXc型临床罕见，到目前为止全世界对该病的报道只有27例，其中多数来自于欧洲和美洲，亚洲沙特阿拉伯3例和日本2例，国内尚无此病的报道和研究。自1996年Maichele等首次对PHKG2基因的gsd突变大鼠的进行研究报道之后，国外再无新突变体外功能学研究。本研究对1例GSD IXc型患儿进行临床资料的回顾性分析和PHKG2基因检测，总结临床表型和基因学特征，并进行PHKG2基因新突变的功能学研究，可以进一步提高对该病的认识和明确PHKG2基因突变的致病性和分子发病机制，丰富了PHKG2基因突变的功能性研究，为疾病预后、遗传咨询和产前诊断建立基础；同时提高了对γ亚基结构的认识，为将来进一步研究PhK与其他物质相互作用提供基础，为GSD IXc型的新治疗方案的探索提供有价值的信息。 目的： 对GSD IXc型患儿的PHKG2基因突变进行鉴定，探讨该病的临床特征和PHKG2基因新突变的致病性；建立PHKG2基因体外瞬时转染体系，探讨突变蛋白的表达变化和致病性。 方法： 1.本研究对二代测序筛查出1例GSD IXc型患者的临床资料进行回顾性分析。 2.对GSD IXc型患儿的PHKG2基因进行Sanger测序验证。查找HGMD和已报道文献证实突变是否已报道，查找SNP和千人基因组数据库是否为多态位点突变。 3.对新错义突变进行12个物种突变点的氨基酸保守性分析，应用SIFT、Polyphen-2软件在线分析预测新的错义突变的致病性。 4.使用PyMOL软件对PHKG2基因新发错义突变的蛋白三维结构构象进行预测。 5.提取患儿、生物学父母和同龄健康对照儿童全血总RNA，进行qRT-PCR检测PHKG2基因的mRNA表达差异。 6.以表达增强型绿色荧光蛋白的质粒p.cDNA3.1-EGFP为空载体，构建p.cDNA3.1-PHKG2-EGFP野生型质粒，通过定点诱变成含新发突变位点、含已知致病突变位点和含一种多态位点的四种突变型质粒，将上述质粒瞬时转染入COS-1细胞，再采用qRT-PCR检测细胞内PHKG2基因的mRNA表达水平，采用免疫荧光法和Western blotting法检测PHKG2蛋白蛋白表达情况，对2个新突变的致病性进行鉴定。 结果： 1.临床资料：确诊的1例GSD IXc型患儿新生儿期起病，表现为肝脏肿大，肝酶升高，空腹低血糖，乳酸升高和代谢性酸中毒。无明显体格生长迟缓，无血脂增高。 2.测序验证：GSD IXc型患儿PHKG2基因存在复合杂合新突变：1个为错义突变c.698T>C(p.Phe233Ser)，另一个为小插入突变c.957_958insGG(p.Gly319GlyfsX6)。 3.致病性预测：新发的错义突变位点c.698T>C(p.F233S）在12个不同物种的氨基酸比对中提示高度保守。对新发错义突变F233S进行SIFT和Polyphen-2软件预测分析，结果提示SIFT评分接近0，Polyphen-2评分接近1。 4.蛋白的晶体结构预测：新发错义突变F233S改变了Loop上与其他氨基酸的连接，与H9的M241形成了不稳定的氢键。 5.外周血qRT-PCR检测：患儿PHKG2基因的mRNA表达水平显著降低；患儿父母各自的mRNA表达水平显著增高。 6.细胞体外功能表达检测： （1）qRT-PCR检测发现野生型和突变型的PHKG2基因mRNA表达水平均较空载组显著升高，新发的错义突变F233S组的mRNA水平较野生型组表达减少，插入突变组G319fsX表达未见减少。 （2）免疫荧光和Western blotting结果提示2种新突变的PHKG2蛋白表达较野生型减少。 结论： 1.本研究报道了国内首例GSD IXc型病例，其临床表现肝脏肿大，肝酶升高，空腹低血糖，和代谢性酸中毒。 2.本研究发现PHKG2基因2种新突变c.698T>C(p.Phe233Ser)和c.957_958insGG(p.Gly319GlyfsX6)，丰富了PHKG2基因突变谱。 3.本研究首次对GSD IXc型患儿家系进行外周血PHKG2基因的mRNA表达比较分析，首次构建含人PHKG2基因的p.cDNA3.1-PHKG2-EGFP质粒和对2种新突变蛋白进行体外表达功能学鉴定。生物信息学和功能表达均提示2种新突变可能为致病突变。