【摘 要】
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β-半乳糖苷酶作为外切糖苷酶,可高效催化水解糖复合物中的非还原端半乳糖残基,释放出游离的半乳糖。仅2020年,无乳糖奶的预期额将高达10亿欧元以上,现有的β-半乳糖苷酶无法满足市场需求,而国内乳糖酶的产能也无法填补我国乳糖酶的需求缺口,每年需进口大量的乳糖酶,价格昂贵。且受市场影响,中低温半乳糖酶需求量也有所增加。因此开发一款新型的β-半乳糖苷酶是我们急需解决的任务。本实验主要研究对象为Lacto
【基金项目】
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国家重点研发计划（2017YFD0400600）“现代食品加工及粮食收储运技术与装备”项目；
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β-半乳糖苷酶作为外切糖苷酶,可高效催化水解糖复合物中的非还原端半乳糖残基,释放出游离的半乳糖。仅2020年,无乳糖奶的预期额将高达10亿欧元以上,现有的β-半乳糖苷酶无法满足市场需求,而国内乳糖酶的产能也无法填补我国乳糖酶的需求缺口,每年需进口大量的乳糖酶,价格昂贵。且受市场影响,中低温半乳糖酶需求量也有所增加。因此开发一款新型的β-半乳糖苷酶是我们急需解决的任务。本实验主要研究对象为Lactobacillus brevis ATCC 367源的β-半乳糖苷酶。Lactobacillus brevis常见于发酵白菜或酸菜中,是一种食源性益生菌,安全性高。该β-半乳糖苷酶是由两个不同的亚基组成。本文以Lactobacillus brevis源β-半乳糖苷酶为研究对象,构建不同的原核表达载体,从中筛选出能够高效、活性表达该异源二聚体半乳糖苷酶的共表达载体,并对其酶学性质及应用进行了探讨。具体研究内容如下:1、合成Lactobacillus brevis源的异二聚体基因LbGalA和LbGalB,进行基因克隆,构建异二聚体共表达载体（LbGalA&LbGalB、LbGalAB）以及设计6条不同长度的肽链连接亚基形成融合蛋白表达载体（Linker1、Linker2、Linker3、Linker4、Linker5、Linker6）。对该异二聚体进行同源分析,将保守位点第468和536位的谷氨酸定点突变成丙氨酸。构建好的所有表达载体转进大肠杆菌BL21（DE3、LacZ-）的感受态细胞中,进行异源表达。2、利用酶标仪对所有重组酶的酶活（单个蛋白亚基、突变体、2个共表达蛋白以及6条融合蛋白）以底物pNP-β-galactose进行活性评估。单个蛋白亚基,二者蛋白混合物以及突变体均没有检测到β-半乳糖苷酶活性;单质粒共表达蛋白LbGalAB的酶活优于双质粒共表达蛋白;融合β-半乳糖苷酶的酶活性大致可与LbGalAB异二聚体的活性相媲美。除了融合酶“Linker 3”酶活性比LbGalAB略低外,融合蛋白的活性随接头linker的长度增加而增强。检测鉴定重组蛋白酶经镍柱纯化后的样品,发现融合蛋白无法纯化出目的条带,而单质粒共表达蛋白LbGalAB在聚丙烯酰胺凝胶电泳上有两条明显的大小不一的条带,分子量分别在大约71 KDa和35 KDa处,这与理论异二聚体的蛋白亚基大小的一致。3、对纯化后的单质粒共表达蛋白LbGalAB进行酶学参数鉴定,发现其最适pH为7.5,最适温度为30℃,在16℃下能保持较长时间的活性。其酶活不依赖金属离子,镁离子能显著提升其活性。表面活性剂SDS对酶的抑制作用明显。酶的比活力为366 mU/mg,对不同底物的动力学参数如下:对pNP-β-galactose的Km值为1.1 mM,最大反应速率为405 μM/min,对乳糖的Km值为5.6 mM,最大反应速率为49.4 μM/min,对N-乙酰-D-乳糖胺的Km值为8.7 mM,最大反应速率为13.6 μM/min。4、纯化后的LbGalAB半乳糖苷酶在人乳、牛乳以及山羊乳中进行实际应用,发现在16℃下作用1小时,反应体系中98%的乳糖全部水解完全,而相关研究表明在相同乳量的反应条件下,其他乳糖酶需要的时间更久（24小时及以上）,需要的乳糖酶量更多。因此偏中性的重组乳糖酶LbGalAB在低温水解乳糖时具有较好的潜在应用价值。
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