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禽流感的频繁暴发,给世界养禽业造成了巨大的经济损失,甚至危及人类的身体健康和生命安全。随着禽类转基因技术的发展,将具有抗流感病毒活性的基因导入动物体内,培育具有抗禽流感特性的转基因鸡新品种,已成为重要的研究目标。但由于高致病性禽流感具有潜伏期短、发病急剧的特性,仅导入一种抗病毒基因很难达到理想目标。培育整合两种或两种以上候选基因的抗病毒转基因鸡新品种将是未来的研究方向。以本实验室成功筛选出的抗高致病性禽流感病毒H5N1FJ13株的siRNA NP604和抗HA蛋白的单链抗体可变区分子scFv1、scFv2和scFv3为基础,开展了一系列研究,获得了如下研究结果：首先通过ELISA实验,筛选出了与病毒结合能力较强的scFv1分子。用插入了scFv1基因的分泌型真核表达载体pIRES2-scFv1和siRNA NP604真核表达载体psiSTRIKE-NP604转染DF-1细胞,转染成功后感染AIV FJ13株病毒。通过Real-time PCR检测,结果显示从感染后12h到60h,同时转入两种抗病毒基因的细胞中病毒的拷贝数明显低于仅转入一种基因的细胞(P<0.05)。将在细胞内稳定表达的siRNA NP604基因和带有信号肽的scFvl基因分别插入慢病毒载体GV115(共表达EGFP荧光蛋白报告基因)和GV206上,将这两个载体分别与辅助载体一起共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,浓缩后,通过荧光显微镜观察和Real-time PCR的方法测定其滴度,分别为2E+9TU/mL和2.00E+8TU/mL.通过western blot检测证明新构建的scFv1慢病毒载体能够在细胞中表达scFv1蛋白并能够分泌至细胞外。利用慢病毒显微注射鸡胚血管法进行转基因鸡的制备。将1μL siRNA NP604和scFv1慢病毒浓缩液分别显微注射到HH13-15期的胚胎外周血管中,慢病毒颗粒感染此时血液循环中大量存在的原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs),目的基因就会整合到PGC中。共分4批注射327枚种蛋,其中注射siRNA NP604慢病毒的种蛋119枚、注射scFvl慢病毒的种蛋208枚,分别孵化出雏鸡58只和98只。经血液基因组PCR检测分析,获得siRNA NP604阳性嵌合体雏鸡20只,scFv1阳性嵌合体雏鸡19只。Western blot检测结果显示,在阳性嵌合体雏鸡血液中均可表达EGFP蛋白或scFvl蛋白。在荧光显微镜下观察siRNA NP604阳性嵌合体雏鸡各组织切片,可以看到其肌肉、肠、胃、脾脏、心脏、肝脏、血细胞、气管及性腺中均有绿色荧光蛋白表达。将阳性嵌合体雏鸡饲养至性成熟,采集公鸡精液,通过Real-timePCR的方法比较精液基因组中外源目的基因拷贝数,其中A29、A39、B7和B12四只阳性嵌合体公鸡精液基因组中外源目的基因的拷贝数较高,分别为0.20、0.13、0.025和0.065。下一步的阳性嵌合体公鸡的传代实验正在进行中。本研究为进一步通过传代育种获得同时具有细胞内外两道特异性抗AIV H5N1防护屏障的转基因鸡的工作奠定了坚实的基础。