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乳腺癌占所有女性肿瘤的25％，是女性一种常见的恶性肿瘤，已成为女性死亡的主要原因[1]。乳腺癌的发生经历了以下几个阶段：正常-普通导管增生-不典型增生-导管原位癌-乳腺浸润性导管癌，探讨与乳腺癌动态发展过程相关的基因对治疗乳腺癌具有重要意义[17]。
TRAF4定位于乳腺癌组织细胞浆及核，细胞核表达与侵袭性增高呈负相关胞浆表达与侵袭性增高呈正相关。使用Northern blot和原位杂交方法，证明TRAF4在小鼠胚胎发生过程中高表达，且在胚胎13.5天时达高峰。在发育中的神经上皮、神经嵴细胞密集处、第1、2、3鳃弓、胸腺、唾液腺及小肠中有TRAF4基因表达[9]．。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）是重要胞浆衔接蛋白。参与调节NF-κB、JNK等信号传导通路，调节细胞的增殖、存活与凋亡[18]。肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)是重要胞浆衔接蛋白。参与调节NF-κB、JNK等信号传导通路，调节细胞的增殖、存活与凋亡[2][3]。
TRAF1与2，2与5，3与5形成同源或异源多聚体。其中TRAF1介导TRAF2与TNFR2胞浆区作用促进NF-κB的活化TRAF3降低TRAF2、5介导的经典NF-κB途径激活增强TRAF6介导的非经典NF-κB途径的激活TRAF2是TRAF家族核心成员主要参于TNFR家族信号转导。TRAF4是TRAF家族唯一在细胞核表达尚未见与其它TRAF家族成员相互作用的报道。我们研究发现乳腺癌细胞系中TARF2可以与TRAF4相结合并且影响TRAF4的表达，同时TRAF4可以调节乳腺癌细胞的增殖。
材料与方法:
1、乳腺组织
本研究选取了80例乳腺组织标本，均来自中国医科大学附属第一临床学院2008-2009年肿瘤外科手术切除的标本，所有患者术前均未接受放、化疗。标本经4％中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。其中部分癌旁乳腺组织（远离肿瘤至少5厘米）和癌组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。
2、免疫组织化学染色及结果判定
标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片，经脱蜡，脱苯，水化后，采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测TRAF2和TRAF4蛋白表达。多克隆抗TRAF2和TRAF44℃孵育过夜。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定：TRAF2和TRAF4以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(×400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数，按TRAF2和TRAF4表达百分率分为以下四个等级：0％为0分，1％-50％为1分，51％-75％为2分，＞75％为3分。根据免疫组化染色强度分为三个等级：浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分＜4者判定为阴性，积分≥4为阳性。
3、细胞培养
用含10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2的条件下培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7 MAD-MB-435，人乳腺正常上皮细胞系MCF7-10A。
4、转染
按照LipofectAMINE2000说明书操作。
5、RT-PCR
检测TRAF2mRNA，TRAF4mRNA表达情况
6、Western blot
检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7，MDA-MB-435中TRAF4表达情况，转染TARF2/siTRAF2后TRAF4的表达情况。
7、MTT法检测细胞增殖
将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含104个细胞，培养24小时，每孔加入MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)溶液继续培养4小时，加入DMSO，490nm波长下测定各孔吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。
8、统计分析
各组资料利用SPSS for Window13.0进行统计分析。p＜0.05有统计学意义。
结果:
1、TRAF2和TRAF4在乳腺癌组织中表达的相关性分析
免疫组化结果显示：
(1)TRAF2的总蛋白表达与TRAF4表达存在正相关性。（r=0.433，p＜0.05）。
(2)TRAF4核与TRAF2浆蛋白表达呈负相关。（r=-0.133，p＜0.05）
2、TRAF4在乳腺癌中的表达
(1)RT-PCR显示：
TRAF4和TARF2 mRNA在乳腺癌中高表达。
(2)Western blot显示：
乳腺癌组织中TRAF4总蛋白表达高于正常细胞，乳腺癌细胞系中总蛋白的表达高于正常细胞并且核蛋白表达量在正常细胞中表达高，癌细胞表达低。浆蛋白的表达量为癌中高于正常。
3、TRAF2对TARF4表达的影响
(1)RT-PCR显示：
转染hTRAF2pIPCX-HA-Flag MDA-MB-231细胞中TRAF2促进TRAF4mRNA表达说明TRAF2在基因水平上调控TRAF4的表达
转染TRAF2siRNA后MDA-MB-231细胞中TRAF2抑制TRAF4mRNA表达说明TRAF2在基因水平下调控TRAF4的表达
(2)Western blot显示：
转染hTRAF2pIPCX-HA-Flag后MDA-MB-231细胞中TRAF4的改变-高表达TRAF2，上调TRAF4的表达
转染TRAF2siRNA后MDA-MB-231细胞中TRAF4的改变-低表达TRAF2，下调TRAF4的表达
4、转染TRAF4促进乳腺癌细胞的增殖能力
MTT法测定结果显示：pcDNA3-TRAF4质粒转染的细胞增殖能力明显高于空白对照组和lipo对照组(p＜0.01）；而对照细胞间相比无明显差异(p＞0.05)。TRAF4siRNA质粒转染的细胞增殖能力明显低于空白对照组和lipo对照组(p＜0.01)；而对照细胞间相比无明显差异(p＞0.05)。
结论:
1、TRAF2的总蛋白表达与TRAF4表达存在正相关性。TRAF4核与TRAF2浆蛋白表达呈负相关
2、TRAF4在乳腺癌细胞系中mRNA呈高表达。正常细胞中TARF4核蛋白的表达高于癌细胞中TARF4的表达。癌细胞中TRAF4浆蛋白的表达高于正常乳腺细胞
3、转染hTRAF2pIPCX-HA-Flag可以上调TRAF4的表达；转染TRAF2siRNA可以下调TRAF4的表达