论文部分内容阅读
针对铜绿假单胞菌对p-内酰胺类抗生素日益严重的耐药压力,本课题模拟p-内酰胺类抗生素抑菌机制,以铜绿假单胞菌的粘肽合成酶PBP3为靶点,进行了大规模虚拟筛选,获得了200多个具有全新结构的先导化合物,为日后新型抗菌药物的研发提供了物质基础。选取一个有代表性的先导化合物进行了合成,对虚拟筛选结果进行验证,同时就先导化合物对冷鲜肉的保鲜效果进行了探讨,主要结论如下：1.以铜绿假单胞菌的PBP3蛋白作为筛选靶点,通过分子对接软件DOCK 6.5对含有104万个小分子化合物的ZINC数据库进行大规模虚拟筛选。经过Grid score、Amber score二轮筛选最终的到了与PBP3有高亲和力的先导化合物约200个。查询美国化学文摘(CA)等数据库,未发现这些化合物在抗菌方面的相关研究报道,说明是新化合物,而且这些新化合物普遍拥有和β-内酰胺类抗生素不同的结构。2.选取编号为ZINC00310847的化合物进行合成,同时合成了其5种衍生物。抑菌实验结果表明,先导化合物及其衍生物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有一定的抑制效果,MIC在200-400μg/mL之间,好于茶多酚对照组(MIC为0.8-1.6 mg/mL),但是远差于氨苄青霉素钠对照组(MIC为12.5 μg/mL)。MTT实验结果显示,在0.2-3.2 mg/mL浓度范围内,先导化合物及其衍生物对小鼠肝细胞的毒性等级为1级,可认为是无毒性的。3.将先导化合物进行荧光修饰,使其作为荧光探针与PBP3高度表达的菌体蛋白相结合,进行SDS-PAGE电泳,发现荧光条带位置与PBP3条带位置是一致的,表明先导化合物可以很好的与PBP3蛋白结合；以先导化合物对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度,按1%(V/V)的接种量在液体培养基中加入供试菌,37℃摇床继续培养2h,提取菌种,制样,通过透射电镜观察发现,与正常培养的细菌相比较,经过先导化合物处理的铜绿假单胞菌细胞壁有不同程度的缺损,表明表明先导化合物能够破坏细菌的细胞壁。通过这两个实验可以初步确定先导化合物能够通过与PBP3蛋白结合干扰细胞壁的合成而起到杀菌的目的。4,保鲜实验结果表明,1.6mg/mL先导化合物各项保鲜指标均明显好于空白对照组(P<0.05)；在菌落总数,pH,挥发性盐基氮等指标上先导化合物组也要好于同等浓度的茶多酚对照组,但在色差值相关指标上却差于茶多酚,同时,通过SPSS软件进行统计分析,发现这两组在保鲜结果上并无显著性差异(P>0.05)。