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目的本研究以清开灵注射液为研究对象,采用核酸适配体和免疫磁珠分离技术相结合,分别获得剔除胆酸及桅子苷后的清开灵注射液,然后通过细胞模型研究其致类过敏反应的性质,通过动物模型研究其致过敏反应的性质,旨在明确胆酸和栀子苷在清开灵注射液所致的类过敏反应及过敏反应中的作用。方法本研究主要包括三部分内容:第一部分,将标记有生物素的核酸适配体与包被有链霉亲和素的磁珠偶联,将偶联物与清开灵注射液反应孵育,然后利用磁分离技术剔除其中的目标分子,获得剔除后的清开灵注射液。优化实验条件,剔除尽可能多的目标分子。第二部分:利用RBL-2H3细胞进行类过敏反应实验,对比剔除部分目标分子前后的清开灵注射液对细胞的类过敏作用,从而确定目标分子是否在清开灵注射液致类过敏反应中起作用。第三部分:利用大鼠全身主动过敏实验和皮肤被动过敏反应模型,对比剔除部分目标分子前后的清开灵注射液的致敏作用,进一步验证目标分子是否在清开灵注射液的致过敏反应中起作用。结果1.本实验采用的三条胆酸适配体和一条栀子苷适配体的Kd值分别为:apt1的Kd为17.76μM,apt2 的 Kd 为 8.77μM,apt3 的 Kd 为 8.93μM;栀子苷适配体 N2 的 Kd为6.06μM。2.在核酸适配体与磁珠偶联的反应中,1m1磁珠与不同浓度的胆酸适配体反应,浓度为2μM的适配体与之反应的偶联量最高,可达到0.851nmol;2μM的适配体与不同体积的磁珠反应,磁珠2ml时偶联的适配体最高,可几乎完全将适配体偶联。3.三条胆酸适配体中,apt3适配体与磁珠偶联的能力相对较高,偶联率为42.94%;三种不同品牌的磁珠中,Magbeads磁珠的偶联适配体的量最多,100μl即可偶联0.8724nmol的适配体。4.高效液相检测清开灵注射液中的目标分子浓度,胆酸约为3214.884μg/ml,栀子苷约为446.775μg/ml,符合药典中的标准。在剔除胆酸实验中,清开灵注射液的稀释倍数在原液时,剔除的量最多,可剔除376.448nmol的胆酸。在磁珠量为1ml时,加入清开灵注射液的体积为300μl时,胆酸的剔除率为11.12%。利用同等条件对桅子苷进行剔除,剔除率可达到25.18%5.在细胞类过敏反应实验中,与正常组相比,清开灵注射液干预过的细胞释放的β-氨基己糖苷酶和肿瘤坏死因子-α显著升高。而剔除掉胆酸和梔子苷的清开灵注射液对细胞的脱颗粒作用明显降低。6.在动物过敏实验中,与正常组相比,清开灵注射液组的SD大鼠在致敏后激发时产生了明显的主动过敏反应症状;而剔除掉胆酸和栀子苷后的清开灵注射液引起大鼠主动过敏反应的作用明显减弱;在被动皮肤过敏实验中,与正常组相比,注射了清开灵注射液组的大鼠抗血清的Wistar大鼠产生了明显的被动过敏反应症状;而剔除胆酸和栀梔子苷后的清开灵注射液引起被动过敏反应的作用有明显下降。结论1.本实验中用于剔除清开灵注射液中目标分子所用的核酸适配体的Kd值都在10μM以下,具有较高的亲和力。但是由于现有技术以及反应条件等原因,无法达到100%剔除目标分子的目的。2.清开灵注射液能够诱发RBL-2H3细胞产生脱颗粒效应,使细胞形态发生变化,并且释放β-氨基己糖苷酶和肿瘤坏死因子-α等介质。剔除掉部分胆酸及栀子苷的清开灵注射液引起细胞发生脱颗粒的效应明显减弱,说明胆酸与梔子苷可能在清开灵注射液所致类过敏反应中起重要作用。3.清开灵注射液可导致SD大鼠发生主动过敏反应及皮肤被动反应,剔除部分胆酸及桅子苷后的清开灵注射液引起主动过敏反应和皮肤被动反应的作用明显下降,说明胆酸及栀子苷可能在清开灵注射液所致过敏反应中起重要作用。