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目的本课题以miR155缺陷鼠为模型,检测miR155表达水平变化对肠道DC亚群发育和功能的影响,探讨miR155在IBD发病过程中的作用。方法1.取miR155缺陷鼠组织,提取DNA,扩增后,进行基因鉴定,确定使用的实验组小鼠全身缺失microRNA155。2.稳态下,取小肠,制备miR155缺陷鼠和对照组(C57BL/6)小肠黏膜固有层单细胞,用流式细胞术检测小鼠miR155缺失对小肠黏膜固有层中总DC和各亚群数量及比例的影响。3.稳态下,制备miR155缺陷鼠和对照组(C57BL/6)小肠黏膜固有层单细胞,用Ki67和Annexin V的染色方法,流式细胞术检测小肠黏膜固有层DC亚群的增殖和凋亡。4.稳态下,取miR155缺陷小鼠和对照组小鼠肠系膜淋巴结(mLN),流式细胞术检测mLN中DC亚群数量及比例变化。5.稳态下,取股骨,制备miR155缺陷鼠和对照组(C57BL/6)骨髓单细胞,流式细胞术检测miR155缺失对骨髓中DC前体的影响。6.用GM-CSF和FLT3-L诱导miR155缺陷鼠骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC,在培养的第8、12、16天分别检测CD103~+CD11b~+DC亚群的变化。7.体外诱导骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC,在第15天时,取培养上清,并加入LPS刺激过夜,第16天取培养上清,使用ELISA方法检测miR155缺陷鼠和对照组骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC分泌的炎性因子TNF-α,IL-6。8.流式细胞仪分选miR155缺陷鼠和对照小鼠脾脏DC,分选CD45.1~+OT-II小鼠脾脏Na?ve T细胞,DC和Na?ve T细胞以1:10的比例进行体外共培养,3天后检测Na?ve T细胞的增殖情况。9.建立IBD模型,对比miR155缺陷鼠和对照小鼠肠炎反应的差异。(1)建立小鼠IBD肠炎模型将DSS粉末溶于无菌蒸馏水中,使DSS的终浓度为2.5%,给予小鼠连续喂饮DSS 5天后,换成正常无菌蒸馏水饮用3天。(2)肠炎严重程度评估在造模过程中,每天同一时间记录小鼠体重,观察其粪便的稀软程度及有无便血及严重程度。使用疾病活动指数评分(disease activity index,DAI)评价小鼠肠炎模型是否构建成功,并评价肠道炎症的严重程度。(3)分别在对照组(C57BL/6)和miR155缺陷小鼠中诱导急性肠炎,对比两者急性肠炎严重程度。结果1.我们取miR155缺陷鼠组织,提取DNA,然后进行基因扩增,电泳后发现DNA条带分布在600bp,与jackson laboratory提供的小鼠鉴定标准一致,因此我们确定使用的小鼠是miR155缺陷小鼠。2.稳态条件下,miR155缺失后小肠黏膜固有层总DC及CD103~+CD11b~-DC和CD103~-CD11b~+DC这两群的数量和比例无明显变化,但CD103~+CD11b~+DC亚群的数量明显减少。3.稳定状态下,采用Ki67和Annexin V染色方法检测miR155缺陷鼠小肠黏膜固有层中CD103~+CD11b~+DC的增殖和凋亡,结果发现miR155缺失并不影响此群细胞的增殖和凋亡。4.稳态下,miR155缺陷鼠肠系膜淋巴结中的DC亚群无明显变化。5.稳态下,取小鼠股骨制备miR155缺陷鼠和对照组骨髓单细胞,流式细胞仪检测发现:miR155缺失不影响其他血细胞的前体细胞如MEP、CMP、GMP以及pre-DC的发育,但下调cDC1(CD103~+DC)及其前体细胞(pre-cDC1)的发育,进而可能影响了小肠固有层中CD103~+DC,尤其是CD103~+CD11b~+DC的发育。6.用GM-CSF和FLT3-L诱导miR155缺陷鼠和对照组骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC,在培养的第8、12、16天用流式细胞仪检测两组骨髓来源的总DC的比例,无明显差异,但是,miR155缺陷鼠骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC的比例明显降低。7.体外诱导骨髓来源的CD103~+CD11b~+DC,在第15天时,取培养上清,并加入LPS刺激过夜,第16天取培养上清,使用ELISA方法检测两组骨髓来源的DC分泌的炎性因子(TNF-α,IL-6)发现,炎性因子TNF-α和IL-6,尤其是后者在LPS刺激后与对照组的骨髓来源的DC相比,分泌有下调趋势。8.取miR155缺陷鼠和对照组小鼠的脾脏,制备单细胞,经荧光标记后,用流式细胞仪分选脾脏总DC。制备CD45.1~+OT-II小鼠脾脏单细胞,用流式细胞仪分选Na?ve T细胞,DC和Na?ve T细胞以1:10的比例进行体外共培养,3天后检测Na?ve T细胞的增殖情况,发现miR155缺失后DC刺激Na?ve T细胞增殖的能力降低。9.在IBD模型中,miR155缺陷鼠肠炎反应明显减轻。(1)DSS诱导IBD肠炎模型建造成功。第1~4天,小鼠体重无明显变化,第5、6、7、8天小鼠体重连续下降,在第8天达到最低。(2)分别在对照组(C57BL/6)和miR155缺陷鼠中诱导急性肠炎,结果发现:与对照组相比,miR155缺陷鼠的疾病活动指数评分较低,体重下降不明显。(3)DSS诱导急性肠炎,制备小肠黏膜固有层单细胞,流式检测对照组和miR155缺陷鼠小肠黏膜固有层Th17水平,发现与对照组相比,miR155缺陷鼠小肠黏膜固有层中的Th17数量减少。结论稳态下miR155缺失可导致肠道固有层CD103~+DC,尤其是CD103~+CD11b~+DC数量减少,但不影响该细胞的增殖、凋亡以及迁移,而且,实验发现miR155缺失导致骨髓中的cDC1前体细胞减少,这说明miR155对CD103~+DC发育有调控作用。在IBD模型中进一步研究发现,miR155缺陷对DSS诱导的肠炎有保护作用,这可能与肠道固有层CD103~+DC,尤其是CD103~+CD11b~+DC数量的减少导致的Th17细胞反应下降有关。