研究背景抑郁症（depression）是一种常见的心理或情感障碍,严重者甚至对生活失去信心,产生自杀倾向。它是一种具有高患病率、高复发率、高致残率、高自杀率特点的慢性精神疾患^[1]。随着社会竞争的日趋剧烈,工作节奏的日趋加快,抑郁症患者人数呈明显的增多趋势,严重影响着人们的生活、工作及身心健康。现代临床研究发现,抑郁症常常伴有消化道功能性疾病（functional gastrointestinal disorders,FGD）发生^[2],这与抑郁症肝郁脾虚证的临床表现十分相似。肝郁脾虚证作为抑郁症的常见证型之一,近年来受到国内学者广泛关注。中医认为,抑郁症早期常表现为肝郁气滞证,日久肝气郁结,气机不畅,升降失常,横逆犯脾,导致脾虚症状形成肝郁脾虚证。常表现为情绪抑郁和脘腹胀痛、食少纳呆、泄泻等胃肠道功能减弱的症状。国际上应用抗抑郁西药治疗胃肠功能紊乱的临床研究比较广泛^[3],但其易产生耐药性和副作用。中医药学在治疗抑郁症的过程中,积累了丰富的理论知识和临床经验。近年来国内对抑郁症的中医病因病机、诊断辨证、治则方药、基础实验等方面进行了较为广泛而卓有成效的研究,因此,在中医药理论指导下,运用现代科学方法研究中药抗抑郁作用及其机理,寻找和开发安全可靠的抗抑郁药物具有重要意义。逍遥散源自宋朝官修本草《太平惠民和剂局方》,是中医解郁之经典名方,具有疏肝解郁、健脾和营的功效。且研究证实,传统中药方剂逍遥散对抑郁症及其并发的肠道症状有较好的疗效^[4],与西医抗抑郁药物相比,其具有抗抑郁疗效持久、副作用低等优点,但其具体机制尚不明确。因此,从胃肠功能方面,深入了解抑郁症与肠道功能紊乱的相关性,有助于更好地理解抑郁症的发病机理,为临床逍遥散治疗抑郁症并发FGD提供新的科学依据。研究目的本研究结合课题组前期工作基础,对6周慢性不可预知温和刺激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）建立的抑郁症肝郁脾虚证大鼠结肠通透性的变化进行研究,探讨抑郁症肝郁脾虚证肠道通透性改变的机制以及逍遥散的调节作用。以期为抑郁症肝郁脾虚证的生物学内涵的诠释奠定基础,为逍遥散的抗抑郁机制提供新的理论。研究方法1.实验选用SPF级SD雄性大鼠60只,6-7周龄,大鼠按初始体重随机分为正常组、模型组、逍遥散组和氟西汀组,每组15只,5只一笼。2.适应性喂养7天后,除正常组自由饮水和进食无刺激外,另外三组连续6周受到各种不可预知的温和刺激,同时逍遥散组和氟西汀组大鼠分别进行逍遥散和氟西汀灌胃干预,正常组和模型组灌服等体积去离子水。3.观察记录大鼠一般情况,包括宏观表征、体重和摄食量。4.行为学实验:旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验对大鼠的焦虑抑郁程度进行评价。5.ELISA法检测大鼠血清D-木糖含量的改变,进一步验证此模型是否具有脾虚证。6.采用HE染色、PAS染色和超微病理观察大鼠结肠病理组织学变化。7.利用免疫组化、Western Blot、PCR技术,检测抑郁症肝郁脾虚证大鼠结肠ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白和基因的表达。8.采用免疫组化、Western Blot技术检测大鼠结肠组织中P38、ERK以及JNK蛋白磷酸化水平。9.采用ELISA法观察逍遥散干预治疗前后抑郁模型大鼠下丘脑及结肠中5-HT、SP和VIP的含量变化。研究结果1.大鼠一般情况观察结果:模型组大鼠精神状态差、倦怠嗜卧,喜欢蜷缩、扎堆,毛发杂乱干枯发黄、耳廓和鼻头肤色变淡无光、眼裂粘膜色淡、目眦有明显分泌物,叫声无力、拱背现象消失,粪便干湿不调,出现便溏。逍遥散组、氟西汀组大鼠与模型组相比一般状态均明显改善。各组大鼠体重变化:与正常组比较,模型组从第2周末开始到第6周末体重显著下降（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散干预的大鼠从第3周末药物作用开始显现,到第6周末逍遥散组体重显著上升（P<0.01）;与模型组比较,氟西汀组从第4周末开始体重明显增加（P<0.05）,到第6周末体重显著增加（P<0.01）。各组大鼠摄食量变化:与正常组比较,模型组从第3周开始摄食量显著下降（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组从第4周开始摄食量显著增加（P<0.01）,氟西汀组从第3周开始摄食量明显上升（P<0.05）,从第4周以后摄食量显著上升（P<0.01）。2.行为学检测结果:旷场实验结果提示:与正常组比较,模型组大鼠运动总距离、进入中央区次数、中央区停留时间、总穿格数、站立次数均显著减少（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组和氟西汀组大鼠运动总距离、进入中央区次数、中央区停留时间、总穿格数、站立次数均显著增加（P<0.01）。而修饰次数,四组大鼠均无明显差异。强迫游泳5 min内不动时间比较:与正常组比较,模型组大鼠强迫游泳5 min内不动时间显著增加（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散能显著降低鼠强迫游泳5 min内不动时间（P<0.01）;氟西汀组虽有轻微下降,但无统计学意义（P>0.05）。糖水偏好实验结果比较:（1）造模前,各组大鼠均无差异（P>0.05）。（2）造模结束后,与正常组比较,模型组大鼠糖水偏好显著减少（P<0.01）。与模型组比较,逍遥散组和氟西汀组糖水偏好显著增多（P<0.01）。3.血清血清D-木糖检测结果:与正常组比较,模型组大鼠血清D-木糖含量显著减少（P<0.01）。与模型组比较,逍遥散组血清D-木糖含量显著增多（P<0.01）,氟西汀组明显增多（P<0.05）。4.大鼠结肠病理组织学变化:（1）HE染色结果:正常组大鼠结肠结构完整,肠腺排列良好。模型组上皮结构破坏,肠腺减少,甚至消失;此外,固有层黏膜有炎性细胞浸润。与模型组相比,逍遥散组和氟西汀组均减轻了炎症细胞的浸润和腺体损伤的程度。（2）PAS染色结果:在CUMS 6周后,结肠中杯状细胞的数量与空白组比较显著下降（P<0.01）,逍遥散组和氟西汀组在药物的干预下,逆转了CUMS引起的杯状细胞数量下降的趋势,逍遥散组与模型组比较杯状细胞数量显著增加（P<0.01）,氟西汀组与模型组比较杯状细胞数量明显增多（P<0.05）。（3）透射电子显微镜检测结果:正常组显示规则的柱状细胞,肠上皮完整、微绒毛整齐、紧密连接。模型组微绒毛分布稀疏杂乱,细胞间连接复合物被破坏,细胞间空间变宽,紧密连接的顶端部分被破坏。逍遥散组微绒毛的大小和数量增加,绒毛排列较模型组致密、整齐,紧密连接的破坏得到明显改善。氟西汀组微绒毛的大小,数量和排列也得到了改善,但是细胞间连接复合物的损伤和紧密连接蛋白的破坏没有得到明显改善。5.免疫组化结果:（1）造模后大鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的OD值显著下降,与正常组比较有显著差异（P<0.01）;逍遥散组结肠ZO-1的OD值较模型组有明显增加（P<0.05）,而Occludin和Claudin-1的OD值较模型组显著增加（P<0.01）;氟西汀组较模型组无明显差异（P>0.05）,而Occludin和Claudin-1的OD值与模型组比较明显增加（P<0.05）。（2）模型组大鼠结肠中P-P38、P-ERK、P-JNK蛋白表达与正常组比较明显增加（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组P-P38、P-JNK蛋白表达显著下降（P<0.01）,P-ERK蛋白表达明显下调（P<0.05）;与模型组比较,氟西汀组P-P38、P-ERK蛋白表达降低（P<0.05）、P-JNK蛋白表达显著下降（P<0.01）。6.Western Blot检测结果:（1）与正常组比较,模型组大鼠结肠ZO-1、Claudin-1蛋白表达显著减少（P<0.01）,Occludin蛋白表达明显减少（P<0.05）;与模型组比较,逍遥散组和氟西汀组ZO-1、Claudin-1蛋白表达均显著增加（P<0.01）,逍遥散Occludin蛋白的表达明显上升（P<0.05）,氟西汀组Occludin蛋白的表达无统计学意义（P>0.05）。（2）与正常组比较,模型组大鼠结肠P-P38、P-JNK均显著增加（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组P-P38、P-JNK显著下降（P<0.01）,氟西汀组P-P38明显下降（P<0.05）、P-JNK显著下降（P<0.01）。各组大鼠结肠P-ERK均无明显差异（P>0.05）。7.PCR检测结果:（1）ZO-1mRNA表达:与正常组比较,模型组明显减少（P<0.05）;与模型组比较,逍遥散组和氟西汀组明显增加（P<0.05）。（2）Occludin mRNA表达:与正常组比较,模型组显著下降（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组和氟西汀组均显著增加（P<0.01）。（3）Claudin-1mRNA表达:与正常组比较,模型组明显下降（P<0.05）;与模型组比较,逍遥散组显著增加（P<0.01）,氟西汀组亦明显增加（P<0.05）。8.ELISA法检测结果:（1）5-HT、VIP含量比较:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑与结肠5-HT、VIP含量显著下降（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组下丘脑与结肠5-HT、VIP含量显著上升（P<0.01）,氟西汀组下丘脑5-HT含量显著增多（P<0.01）,下丘脑VIP和结肠5-HT、VIP含量明显增多（P<0.05）。（2）SP含量比较:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑与结肠SP含量显著升高（P<0.01）;与模型组比较,逍遥散组下丘脑与结肠SP含量显著降低（P<0.01）,氟西汀组下丘脑与结肠SP含量明显降低（P<0.05）。研究结论1.采用6周CUMS构建大鼠肝郁脾虚型抑郁症模型,通过动物宏观表征、各种行为学实验、血清D-木糖含量以及逍遥散的调节作用以方测证,对此模型进行评价,本研究成功复制了抑郁症肝郁脾虚证动物模型。2.根据抑郁症肝郁脾虚证模型大鼠结肠病理组织学形态的改变,ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白和基因的表达等研究结果,可综合判定肝郁脾虚证模型大鼠结肠黏膜屏障功能损伤,肠道通透性增加。逍遥散对抑郁症肝郁脾虚证大鼠结肠通透性的变化具有调节作用。3.根据检测激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号传导通路中相关蛋白激酶（P38、ERK、JNK）磷酸化水平的结果,表明逍遥散对肠道保护作用与结肠MAPK信号通路有关。4.根据观察逍遥散干预治疗前后抑郁模型大鼠下丘脑及结肠中5-HT、SP和VIP的含量变化,表明抑郁症肝郁脾虚证肠与脑的关系以及逍遥散抗抑郁的作用机制。