[研究背景]胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,起源于神经上皮外胚层,约占颅内恶性肿瘤的40%-65%。它具有高度异质性和侵袭性,特征为细胞增殖紊乱、弥漫性浸润。我国呈逐年增加且年轻化趋势,病理类型以多形性胶质细胞瘤为主。根据病理组织学特点世界卫生组织(WHO)将原发胶质瘤分为4级,I级恶性程度最低、预后最好,IV级恶性程度最高、预后最差,级别越高代表恶性程度越高。随着医疗技术的进展,尽管运用了包括手术切除、放射治疗、药物化疗等多种治疗方法相结合的综合治疗,大部分胶质瘤病人生存期依然维持在12个月之内。究其原因,胶质瘤常发生在颅内深部及大脑功能区并向周围脑组织浸润性侵犯,与正常脑组织分界不清导致胶质瘤很难被完全切除,肿瘤的复发成为患者死亡的主要原因。胶质瘤的形成及侵袭转移是一个多因素、多步骤的病理过程。因此探寻胶质瘤的早期诊断和治疗的分子靶点的切入点是目前亟待解决的问题。微小RNA(miRNAs)是一类非编码RNA,其长度大约为18-25个核苷酸。miRNAs并非通过编码蛋白质的表达影响生物功能,而是与靶基因的mRNA的3’-UTR(untranslated regions)完全或非完全配对,从而抑制靶基因的转录或者促进靶基因的降解来发挥生物调节功能。成熟的miRNAs可以以碱基互补配对的方式识别并结合靶mRNA,进而调控降解靶mRNA或抑制其翻译。20世纪90年代初,miRNAs被发现并开始陆续报道,但是随着研究的深入,miRNAs的异常表达被证明参与多种肿瘤的发生和进展,并扮演重要角色。miRNAs通过参与调控靶基因的信号通路进而调节肿瘤的发生发展,发挥类似致癌基因或抑癌基因的作用。利用这一点,通过干预相应的miRNAs的表达,诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭成为肿瘤防治的一个新的方向。多种miRNAs在恶性肿瘤组织与正常组织中存在明显表达差异。miRNAs并不直接参与肿瘤的形成和进展,需要通过靶向相关蛋白来调控肿瘤细胞的生物学行为,例如miR-15和miR-16通过靶向抑制凋亡基因BCL2的表达,诱导慢性淋巴细胞白血病中白血病细胞的凋亡;而miR-21和miR-155在乳腺癌中表达上调,miR-10b和miR-125b表达下调,则分别提示其在乳腺癌中充当抑癌基因和致癌基因的角色;miR-150通过靶向调控ZEB1的表达来阻滞卵巢上皮癌的转移和侵袭。GBM发病相关miRNAs调控功能改变miR-184位于人类第15号染色体q臂的25.1区段,其相应的转录体分子量为84bp。最初在果蝇胚胎中发现。在细胞内成熟miR-184以单链miR-184-3P为主要表达形式。研究表明miR-184对多种肿瘤进展起促进或抑制作用。高级别前列腺癌与低级别前列腺癌相比miR-184表达上调,提示miR-184成为前列腺癌分子标记物的潜在可能性;抑癌基因PDCD4可正向调控miR-184的表达进而靶向调控BCL-2来抑制细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,鼻咽癌中,PDCD4表达下调;人肝细胞癌细胞系和肝细胞癌组织中miR-184高表达,miR-184通过SOX7介导调节Wnt/β-catenin信号通路促肝肿瘤细胞的增殖;基因芯片筛查结果显示miR-184在舌鳞状细胞癌中呈高表达;miR-184在不同的肿瘤表达量不同,有时会起到癌基因或抑癌基因完全相反的作用,因为不同肿瘤的形成及进展会涉及到多种突变基因,而不同肿瘤突变的基因也不同。目前对miR-184在胶质瘤中的生物学功能及调节机制研究相对较少,且尚未有统一的结论,因此,miR-184在神经胶质瘤中的表达,是否与病理级别及病理类型相关,能否成为胶质瘤重要的分子标志物,将成为本文的主要研究内容。MMPs属内肽酶家族,是一类生物活性依赖锌离子的蛋白酶,具有较强的细胞外基质降解能力,其可通过对基底膜的降解、促进肿瘤血管的生成从而加速肿瘤细胞的侵袭。MMP-2和MMP-9在胶质瘤与正常脑组织之间的表达差异,以及其表达是否与miR-184相关,具体调控机制也是本研究的关注点。鉴于此,本研究拟通过分析miR-184在胶质瘤中的表达及对胶质瘤细胞侵袭转移,为临床诊断和治疗提供新的靶点。本研究包括四个部分:1、不同病理级别的胶质瘤与miR-184表达的相关性;2、miR-184对胶质瘤细胞株U87增殖、侵袭及细胞周期的影响;3、侵袭性胶质瘤中MMP-2和MMP-9的表达与miR-184的相关性。4、miRNA-184通过调控TIMP-2改变MMP2的表达。[目的]1.探寻miR-184在不同病理级别的神经胶质瘤中的表达差异,进行miR-184表达差异与生存预后的关联分析。2.体外实验,观察miR-184模拟体、miR-184抑制剂(anti-miR-184)转染至U87胶质瘤细胞后细胞生物学功能的变化。3.分析金属蛋白酶MMP-2和MMP9在胶质瘤中的表达情况及其与miR-184的关系。4.探寻miR-184与MMP-2和MMP9关联的靶基因及其作用方式。[材料与方法]1.胶质瘤组织及正常脑组织标本的收集、U87胶质瘤细胞株的获取:收集2015年01月至2016年01月入我院病理确诊为胶质瘤患者共40例,及10例正常脑组织,两组的性别和年龄均具有可比性。人胶质瘤细胞株U87细胞购买于中国科学研究院细胞库。2.RT-PCR及免疫组化实验:分析miR-184在正常脑组织和胶质瘤中的表达差异。同时跟踪统计miR-184表达阳性强度75%分位数组中位生存期与miR-184表达阳性强度25%分位数组中位生存期差异。3.U87细胞转染后分别用MTT法结合克隆形成实验,检测miR-184对胶质瘤细胞增殖的影响;细胞划痕实验检测miR-184对胶质瘤细胞迁移的影响;Transwell侵袭实验检测miR-184对胶质瘤细胞侵袭的影响。4.胶质瘤具有极强的侵袭力,分析其可能与金属蛋白酶家族(MMPs)有关,胶质瘤脑组织及正常脑组织冰冻切片进行免疫组织化学染色及U87胶质瘤细胞培养后MMP2和MMP9的mRNA的扩增,分析MMP2和MMP9在组织中的含量差异及基因表达差异。最后用Western Blot检测miR-184-模拟体转染组、miR-184 抑制剂转染组及阴性对照组中 MMP2 和 MMP9 的蛋白表达差异。5.结果显示miR-184与MMP2表达存在正相关后,利用TargetSca靶基因数据库预测miR-184调控MMP2的靶基因为基质金属蛋白酶2抑制因子(TIMP-2)。运用RT-PCR、Western Blot检测TIMP-2表达。同时用荧光素酶双报告实验验证TIMP-2为miR-184改变MMP2的靶基因。[结果]1.miR-184在胶质瘤组织和正常脑组织中均可检测到表达,表达差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-184阳性表达强度与胶质瘤级别呈正相关,胶质瘤恶性程度越高,miR-184阳性表达越强。2.miR-184表达阳性强度75%分位数组的中位生存期明显短于miR-184表达阳性强度 25%分位数组[(8.0±0.4)比(12.0±0.1)月,χ2=12.480,P<0.001]。3.miR-184转染与质瘤细胞的增殖、克隆形成、侵袭迁移能力呈正相关。4.相比MMP-9在胶质瘤和正常组织中的无明显表达差异,MMP-2在胶质瘤的表达水平较正常组织更高。RT-PCR和Westernblot证明miR-184-模拟体转染明显促进MMP2的表达,而miR-184抑制剂转染抑制MMP2表达。MMP9的表达水平在三组中无明显差异。5.TargetSca靶基因数据库提示miR-184促进MMP2表达的潜在靶基因为TIMP-2。实时荧光定量PCR检测U87转染miR-184后TIMP-2表达明显降低。Western Blotting检测miR-184转染组TIMP-2蛋白表达水平明显低于对照组miRNA-184与靶基因TIMP-2表达呈负相关。荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-184可直接作用于TIMP-2进而影响MMP2表达。[结论]1.miR-184在脑胶质瘤中表达上调且与胶质瘤病理分级正相关,提示miR-184可以作为胶质瘤病理分级的标记物。2.miR-184通过抑制TIMP-2进而上调MMP2表达来提高胶质瘤的侵袭力。综上,胶质瘤因为具有高度异质性和侵袭性,且预后极差。探寻胶质瘤的早期诊断和治疗的分子靶点的切入点是目前亟待解决的问题。成熟miR-184以单链miR-184-3P为主要表达形式,miR-184对多种肿瘤进展起促进或抑制作用。目前对miR-184在胶质瘤中的生物学功能及调节机制研究相对较少,因此,miR-184在神经胶质瘤中的表达,是否与病理级别及病理类型相关,是否与胶质瘤的高侵袭性有关,能否成为胶质瘤重要的分子标志物,这些至今未有定论,MMPs被认为在恶性肿瘤的浸润、转移中起着重要作用。miR-184与MMPs的关联,之前的研究中也未有涉及。本研究对miR-184在不同病理级别的神经胶质瘤中的表达差异的影响及miR-184表达差异与生存预后进行了关联分析。发现脑胶质瘤中miR-184表达上调。miR-184过表达与胶质瘤细胞的增殖及侵袭等呈正相关。另外胶质瘤侵袭过程中MMP2明显升高,且受miR-184下游靶分子位点TIMP-2的负向调控。miR-184在胶质瘤中的表达及对胶质瘤细胞侵袭转移的作用,可为临床诊断和治疗提供新的靶点。需要注意的是本研究无法充分模拟再现体内细胞生存环境,无法评估复杂的细胞周围环境对其影响,下一步实验拟增加活体动物实验,观察活体内miR-184对胶质瘤细胞生物学活性的改变。