研究背景和目的： 皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是一种预后极差的恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率明显上升，在中国也成为危及患者生命的重要疾病。目前早期原发性恶性黑色素瘤的治疗主要依靠手术切除，而恶性黑色素瘤极易发生侵袭转移并且对放、化疗等传统治疗手段敏感性较低，因此迫切需要寻找新的治疗方法。 恶性黑色素瘤与其他恶性肿瘤相比，其肿瘤细胞的自发凋亡水平较低，而凋亡不足与肿瘤的侵袭、转移及治疗耐受性明显相关，因此能否有效诱导肿瘤细胞凋亡成为选择恶性黑色素瘤治疗药物的重要标准。目前已证实单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(the herpes simplex virus typeⅠ thymidine kinase/ganciclovir，HSV—TK/GCV)自杀基因系统作为有效的抗肿瘤基因疗法可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到杀伤肿瘤细胞及抑制肿瘤细胞生长的效果。然而单独应用该基因治疗方法仍不能完全消除肿瘤细胞生长，如果能找到一种副作用小同时又能有效诱导肿瘤细胞凋亡的药物与其联合，从而可通过加速肿瘤细胞凋亡来提高基因治疗的效果，那么将为成功治疗恶性黑色素瘤带来新的选择和希望。 中药中的有效成分因其具有较低的副作用已成为我国肿瘤治疗领域的一大特色，临床实验表明单独应用中药或中西医结合方法治疗肿瘤可以取得较好的疗效。二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)是从大蒜中提取的含硫化合物，目前研究证实DATS不仅可以预防肿瘤的发生，而且可以通过诱导凋亡抑制多种肿瘤细胞生长，只是具体的凋亡分子机制尚不完全明确。目前DATS应用于恶性黑色素瘤治疗的研究尚无报导。那么DATS是否也可以通过诱导凋亡及细胞周期阻滞而抑制恶性黑色素瘤细胞的生长呢？DATS联合HSV—TK/GCV系统是否可以发挥协同效应从而提高恶性黑色素瘤的治疗效果呢？如果可以，那两者是否是通过加速细胞凋亡来发挥协同效应的呢，其中的凋亡分子机制又是什么？这些都是本论文要研究的问题。 因此，本研究采用阳离子脂质体构建表达胸苷激酶(TK)基因的恶性黑色素瘤细胞系A375/TK，首先明确DATS、GCV单独作用时均可以有效抑制A375/TK细胞的生长；然后将不同浓度的DATS和GCV进行联合共同作用于A375/TK细胞，证实DATS联合GCV可以发挥协同效应从而提高对A375/TK细胞的治疗效果；通过凋亡及细胞周期分析实验证实，DATS联合GCV可通过加速细胞凋亡及细胞周期阻滞而发挥两种药物的协同效应，同时通过western—blot实验证实凋亡相关蛋白在DATS联合GCV加速细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。本研究为寻找恶性黑色素瘤更有效的治疗方法提供了新的思路及科学的实验依据。 方法： 1、恶性黑色素瘤细胞系A375/TK的构建及RT—PCR鉴定 脂质体转染tgCMV/HyTK进入恶性黑色素瘤细胞系A375，潮霉素B筛选获得稳定生长的阳性克隆细胞，RT—PCR检测TK基因的表达。 2、MTT法分别检测DATS、GCV单独作用时对A375/TK细胞的杀伤作用 不同浓度DATS(0.5μ mol/L—60μ mol/L)或GCV(0.1μ mol/L—50μ mol/L)作用于A375/TK细胞24h，48h，72h，MTT法计算细胞存活率。 3、DATS联合GCV对A375/TK细胞的杀伤作用及协同效应分析 比较分析DATS联合GCV与GCV单独作用时的细胞存活率；中效原理分析(median effect analysis)计算联合作用指数(CI)，判断DATS与GCV的协同效应。 4、凋亡分析实验 将不同药物作用于A375/TK细胞分为四组：阴性对照组、DATS组、GCV组、DATS联合GCV组。sub G1期凋亡峰分析，DAPI染色实验，TUNEL法检测药物作用后细胞凋亡。 5、流式细胞仪检测细胞周期变化 单独应用DATS或GCV及二种药物联合后分别作用于A375/TK细胞72h，收集细胞经PI染色后，流式细胞仪分析细胞周期变化。 6、Western—blot检测凋亡相关蛋白变化 各组药物作用于细胞72h，提取细胞总蛋白，免疫印迹检测Bcl—2，Bax，Bcl—xL/Bcl—xS表达变化；药物作用0h，16h，24h，36h，提取胞浆蛋白，western—blot技术检测胞浆内的细胞色素C。 7、比色法检测caspase—3活性变化 单独应用DATS或GCV及二种药物联合后作用于A375/TK细胞72h，收集细胞提取蛋白，比色法分析caspase—3的活化程度。 结果： 1、RT—PCR证实真核表达质粒tgCMV/HyTK成功转染人恶性黑色素瘤细胞系A375细胞。 2、单独应用DATS、GCV均可明显抑制A375/TK细胞的存活率，DATS和GCV的IC50分别为10.464μ mol/L和1.455μ mol/L。 3、DATS联合GCV组对A375/TK细胞的杀伤效果明显高于GCV单独作用组(P<0.05)；DATS在药物浓度≥2.5μ mol/L和GCV药物浓度≥0.32μ mol/L时，CI值<1，表明将DATS(≥2.5μ mol/L)和GCV(≥0.32μ mol/L)进行联合可以发挥协同效应。 4、单独应用DATS或GCV及二种药物联合后都可以诱导A375/TK细胞发生凋亡，药物联合组所诱导的细胞凋亡率比DATS、GCV单独作用组分别高了2.6倍和1.7倍(P<0.05)。 5、单独应用DATS或GCV及二种药物联合后均可使S期细胞增多，G2期细胞减少(P<0.05)，药物联合组S期细胞比例的增加明显高于DATS、GCV单独作用组(P<0.05)，并引起G1期细胞也减少(P<0.05)。 6、与阴性对照组比较，单独应用DATS或GCV及二种药物联合后均可抑制Bcl—2、Bcl—xL的蛋白表达，药物联合组的这种抑制效果明显高于DATS或GCV单独作用组(P<0.05)；药物联合组在16h从细胞浆中检测到细胞色素C，而DATS、GCV单独作用组在24h才检测到较微弱的细胞色素C。 7、Caspase—3在药物联合组活性最高，是阴性对照组的4.4倍(P<0.05)，而DATS组、GCV组的caspase—3活性各提高了2倍和2.3倍(P<0.05)。 结论： 1、用阳离子脂质体转染技术成功构建了恶性黑色素瘤细胞系A375/TK。 2、单独应用DATS或GCV均可以通过诱导凋亡及细胞周期阻滞而抑制A375/TK细胞生长。 3、DATS联合GCV可通过加速细胞凋亡及细胞周期阻滞而发挥两种药物杀伤A375/TK细胞的协同效应。 4、凋亡抑制蛋白Bcl—2及Bcl—xL在DATS联合GCV加速细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。 5、DATS联合GCV可加速线粒体释放细胞色素C，从而最终激活caspase—3加速A375/TK细胞发生凋亡。 6、DATS联合HSV—TK/GCV系统为更有效治疗恶性黑色素瘤提供了新的思路和科学的实验依据。