1.目的镉(Cadmium,Cd)及其化合物是一类工业毒物和环境污染物,并在职业和环境中长期存在。镉又是一种生物半减期很长(19～30年)的多器官、多系统毒物,如肾损伤、肝损伤、呼吸系统疾病、神经系统障碍、骨骼系统损害,甚至导致多种癌症的发生等。根据国际癌症研究组织(IARC)的报告,镉及其相关化合物是确认的第一类致癌物,是人类危害最大的金属毒物之一。因此,镉暴露及其健康损害,特别是镉低水平长期毒作用已经成为毒理学研究的热点,其中探讨镉暴露特异标志物和相关疾病,是预防和早期诊治之根本。近年来,翻译延伸因子1δ(the mouse translation elongation factor-1δ,TEF-1δ)被鉴定为一个新的镉应答原癌基因。但是,TEF-1δ基因是否可作为潜在的镉暴露生物标志物尚未见报道。本实验通过创建大鼠慢性镉暴露模型,对血中TEF-1δ的表达改变作为新的镉暴露生物标志物进行研究。2.方法2.1通过预实验找出CdCl2染毒SD大鼠100%和0%死亡的剂量范围,求出正式实验的剂量比,以此等比级差设6个剂量实验组和1个对照组,每组8只大鼠,观察大鼠CdCl2急性中毒情况,采用改良寇氏法测定CdCl2溶液腹腔注射对大鼠的LD50。2.2用SPF级别SD大鼠96只按体重随机分4组,3个CdCl2实验组(高剂量1.225mg/kg、中剂量0.612mg/kg和低剂量0.306mg/kg,)和1个生理盐水对照组(0.9% NaCl),每组24只大鼠,雌雄各半,腹腔注射,每周染毒5次,连续14周。之后所有的大鼠均置于代谢笼中收集24小时尿液,然后剖杀收集血液和内脏器官。2.3内脏器官包括肝、肾、心和肺,计算脏器系数并且做病理切片以观察组织形态学变化。测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)作为肝功能生化指标,测定血中尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)、尿肌酐(CR)以及24小时尿蛋白(24hPro)作为肾功能生化指标。2.4血液、尿液和器官组织用原子分光光度计测定其镉的含量。血白细胞和器官组织分别提取总RNA,再用逆转录PCR(RT-PCR)和荧光定量PCR(FQ-PCR)法分析其TEF-1δ因子的表达水平。最后,对血中TEF-1δ因子表达水平与血镉、尿镉、肝镉、肾镉、心镉、肺镉含量和肝肾功能变化以及各器官组织的TEF-1δ因子表达水平之间分别作相关性分析。3.结果3.1急性染毒试验的结果显示,实验大鼠绝对致死量为26.00 mg/kg,最大耐受剂量为11.54 mg/kg,实验剂量组依次为26.00、22.10、18.79、15.97、13.57和11.54 mg/kg。镉中毒大鼠一般在8小时内死亡,少数在72小时内死亡;CdCl2溶液腹腔注射对大鼠的LD50为18.37 mg/kg,95%的可信区间是16.56～20.38 mg/kg。3.2大鼠经过不同镉浓度慢性染毒14周后,不同镉暴露的大鼠血、尿和肝、肾、心及肺脏器中的镉含量均有不同程度升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,存在明显的剂量依赖关系(P<0.01)。实验组大鼠肝、肾、心、肺组织的脏器系数均有不同程度升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有明显的剂量依赖关系(P<0.05)。实验组大鼠肝、肾、心、肺组织的的病理切片中与对照组相比较均观察到病理学改变。镉染毒的大鼠中肝功能生化指标AST和ALT的活性相对于对照组均有升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有剂量-反应关系(P<0.05)。肾功能生化指标Scr、BUN和24小时尿蛋白(24hPro)的活性相对于对照组均有升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有剂量-反应关系(P<0.05)。这些数据显示CdCl2染毒剂量已经引起肝、肾、心、肺组织的不同程度的损害。3.3经RT-PCR分析,血和肝、肾、心、肺中的TEF-1δ因子表达量以β-actin为内参照进行标化计算,初步显示CdCl2染毒的大鼠血、肝、肾、心和肺组织中TEF-1δ的mRNA表达水平均有不同程度升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有明显的剂量依赖关系(P<0.05)。FQ-PCR定量检测结果进一步证实,TEF-1δ表达量以hACTIN为内参照进行标化计算,低、中、高剂量组的TEF-1δ相对拷贝数分别与对照组相比,血细胞分别是2.54倍、4.28倍和23.54倍,肝组织分别是3.59倍、12.53倍和75.00倍,肾组织分别是16.10倍、53.59倍和159.14倍,心组织分别是3.14倍、5.33倍和13.17倍,肺组织分别是2.37倍、3.92倍和8.02倍,显示大鼠血、肝、肾、心和肺组织中TEF-1δ的mRNA表达水平均有不同程度升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有明显的剂量依赖关系(P<0.01或P<0.05)。3.4经过统计学的相关性分析,发现大鼠血中的TEF-1δ的mRNA表达水平与镉在大鼠血、尿、肝、肾、心、肺中的蓄积浓度有正相关关系;与内脏器官肝、肾、心和肺中TEF-1δ表达水平存在明显正相关;大鼠血和内脏器官中的mRNA表达还与肝功能生化指标(AST,ALT)和肾功能生化指标(24hpro,BUN, Scr)异常存在正相关关系,并与肝、肾、心、肺组织的病理学改变相关。结果表明,血中TEF-1δ因子表达水平与大鼠的血、肝、肾、心、肺组织的镉暴露水平及其引起的内脏器官异常效应和脏器TEF-1δ因子表达水平呈现出良好的剂量依赖关系及剂量-反应关系(P<0.01或P<0.05)。4.结论4.1创建了大鼠慢性镉暴露模型,发现镉可以在大鼠血液、尿液、肝、肾、心和肺组织中蓄积,蓄积量表现为:血液>尿液,肾>肝>心>肺;镉可以引起肝、肾、心和肺脏器系数的增大和不同程度的病理改变,同时引起肝和肾功能生化指标改变,反映镉可致肝、肾、心和肺的慢性损害,具有明显的剂量-反应关系,为镉化物的剂量长期毒性补充了新的科学数据。4.2在慢性镉中毒模型中观察到镉对大鼠血及内脏器官翻译延伸因子1δ(TEF-1δ)基因表达的诱导作用,揭示血中TEF-1δ因子表达水平与大鼠的血、肝、肾、心、肺组织的镉暴露水平及其引起的内脏器官异常效应和脏器TEF-1δ因子表达水平呈现出良好的剂量依赖关系及剂量-反应关系。这些数据让我们首次发现,血TEF-1δ的表达改变可成为一个新的、有价值的镉暴露生物标志物和内脏器官镉暴露及其毒效应的替代标志物,并可考虑应用于人群的早期生物学监测。