血管内皮细胞的损伤是多种血管病变的基础,逆转内皮细胞的损伤和促进血管内皮的修复是防治多种血管疾病的关键。同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)血中含量的升高已成为损伤内皮细胞的独立影响因子之一,它可诱导内皮细胞凋亡,并导致某些心血管疾病发生[1] ,caspases家族的存在及其联酶反应是推动细胞凋亡形成的主要因素之一,caspases的活化受各种凋亡抑制因子的抑制,而凋亡抑制蛋白(XIAP)是现知的唯一内源性的凋亡抑制蛋白,如何能启动这些抑制程序,逆转HCY对内皮的损伤修复损伤内皮细胞的功能成为人们探讨心血管疾病的新的热点[2]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓中成体多能干细胞,能分化成三个胚层几乎所有的细胞[3][4][5],有文献表明MSCs能促进组织血管新生[6],那么中药复方能否逆转内皮细胞的凋亡,能否联合骨髓间充质干细胞对内皮细胞的修复,其修复机制与激活凋亡抑制蛋白有无关系,目前尚不清楚。本实验就是基于内皮细胞和骨髓间充质干细胞的联合培养体系观察益气活血复方芪丹通脉片干预下MSCs对损伤内皮细胞的修复作用。研究目的1、原代培养HUVEC及MSCs,采用Transwell建立培养共同培养体系,模拟体内HCY损伤内皮细胞环境,观察在中药复方QDTMT干预下能否修复内皮细胞损伤。2、观察培养液中MDA、SOD、LDH的变化,透射电境下观察HUVEC细胞损伤后的形态学改变。3、检测HUVEC的caspase-3, c-IAP-1, c- IAP -2的表达,初步探讨QDTMT修复HUVEC损伤的机制。研究方法1、含药血清的制备:选用成年SD大鼠24只(体重250-300g),分成3组,2组实行中药灌胃,1组灌生理盐水,3天后,取血清。将自制的含药血清和生理盐水血清用10%DMEM配制成浓度为0.15%,1.5%,15%的培养基。2、细胞培养:采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),采用酶消化法原代培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),MTT法检测含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞活性的影响。免疫组化法对人脐静脉内皮细胞行FⅧ因子辣根过氧化物酶染色。3、采用Transwell培养小室建立共同培养体系,将损伤的HUVEC种在Transwell下室,将MSCs种于上室,模拟体内损伤修复环境。4、紫外线分光光度仪检测细胞培养液中SOD、MDA、LDH的含量,透射电境观察内皮细胞凋亡的形态,免疫荧光染色观察小室上MSCs的诱导情况。5、Hochest33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡率。6、western-blotting检测人脐静脉内皮细胞caspase-3, c-IAP-1, c- IAP -2的表达。研究结果1、用全血贴壁法筛选的MSCs在培养第二天就有贴壁细胞,散在分布,3天就见有不少扁平型和梭型的细胞,传2-3代后呈均一的长梭型,漩涡样生长;HUVEC细胞于36h后可见大量贴壁,呈小圆梭形,2-3d达到80%融合,FⅧ因子染色呈阳性。2、HCY诱导了内皮细胞的凋亡,电境下有明显的核固缩,损伤对照组的MDA与正常和其他各组比较差异显著,单纯干细胞修复组与QDTMT血清组差异不明显;损伤对照组的SOD与正常和其他各组比较差异显著,单纯干细胞修复组与0.15%QDTMT和1.5%QDTMT血清组差异不明显,但与其他组差异比较有统计学意义(P﹤0.05);损伤对照组的LDH与正常和其他各组比较差异显著,单纯干细胞修复组与QDTMT各组比较没有显著性差异。3、Hoechst33258染色及流式细胞仪检测的细胞凋亡率表明,MSCs修复组的细胞凋亡率明显低于损伤组,在QDTMT的干预下,进一步降低了细胞凋亡率。4、western-blotting结果显示,在各修复组中caspase-3的活化下调,而c-IAP-1, c- IAP -2的表达上调。5、在HCY的环境中,在内皮细胞的存在下和QDTMT的干预下,MSCs依然能诱导成为内皮细胞,呈FⅧ因子阳性。研究结论MSCs能修复损伤的内皮细胞,中药QDTMT能促进MSCs的修复过程,可能通过以下两种途径:1,直接提高细胞的抗氧化能力,2.通过上调c-IAP-1, c- IAP -2的表达,抑制caspase-3的活化,从而抑制了细胞的进一步凋亡。