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目的
构建钙网织蛋白基因重组腺病毒载体(Ad-CRT)及联合紫杉醇对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外生长增殖的影响,诱导凋亡的效应及阻滞细胞周期的影响,判断Ad-CRT与紫杉醇联用对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231是否具有协同作用,并初步探讨其可能机制。
方法
根据Genbank中提供的CRT基因序列,设计并合成引物,以人乳腺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人CRT基因片段,测序后将CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重组穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至PacI限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi;分别将不同处理因素作用于体外培养的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法检测各组处理因素对细胞生长抑制作用;PI单染流式细胞术检测各组处理因素对细胞周期和凋亡的影响。
结果
1、重组穿梭载体pShuttle-CRT经EcoRI/KpnI酶切鉴定连接成功。酶切穿梭载体将CRT片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT,鉴定证实Ad-CRT载体构建成功。Ad-CRT转染293LP细胞并通过Westernblot法和Real-timePCR法证实其体外表达。
2、Ad-CRT与紫杉醇对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231生长抑制的影响
联合用药组在72h之前与单纯紫杉醇和单纯Ad-CRT作用效果无明显差异,但在72h后联合用药的效果明显强于各自单纯用药组(P＜0.05)。7days时作用效果最为明显,且随时间的增加联合用药组的抑制率均比单纯紫杉醇组和单纯Ad-CRT组的抑制率高。
3、Ad-CRT与紫杉醇对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞周期及细胞凋亡的影响
与空白对照组相比,各处理组抑制细胞周期的百分比均升高,联合用药组G2/M期为(31.1±1.24)%,S期百分比为(54.93±1.24)%,凋亡率为(26.99±1.24)%,单独紫杉醇组G2/M期为(18.64±2.04)%,S期百分比为(41.19±2.04)%,凋亡率为(12.24±2.04)%和Ad-CRT组G2/M期为(11.25±1.46)%,S期百分比为(47.06±1.46)%,凋亡率为(20.52±1.46)%。结果表明Ad-CRT联合紫杉醇能显著阻滞细胞周期并且促进细胞的凋亡(P＜0.05)。
结论
1、成功构建CRT重组腺病毒载体Ad-CRT并证实其在293LP细胞中表达。
2、Ad-CRT联合紫杉醇能增强抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖,且成时间依赖关系。
3、Ad-CRT联合紫杉醇能够阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。