本文通过同源重组将ac68基因从AcMNPV基因组中缺失，研究了ac68基因缺失对病毒在离体培养细胞和虫体中增殖的影响，同时对ac68基因的转录、翻译等进行了研究。 ac68基因位于AcMNPV基因组58720nt～59298nt之间，阅读框全长579bp，编码192个氨基酸，预计分子量为22.3kDa。序列分析表明，Ac68所有的同源蛋白仅存在于大多数以鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒科核多角体病毒属中，氨基酸序列一致性介于6％-95％之间。通过在线软件(http：//www．expasy．ch)对其序列进行预测发现有6个磷酸化位点，Bioedit 6.0软件预测Ac68蛋白羧基端有一个很大的疏水区域，氨基酸序列结构域分析结果表明，Ac68没有找到相似的已知功能的结构域，推测该蛋白可能为一种与磷酸化修饰相关的蛋白，在病毒生活周期过程中起调节作用。 本文首先根据ac68基因序列设计一对引物，以AcMNPV基因组DNA为模板进行PCR扩增，将得到的这个基因克隆到原核表达载体pET28a，在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫昆明小鼠，制备了该蛋白的多克隆抗体。Ac68多克隆抗血清与AcMNPV感染的Sf-9细胞总蛋白进行的杂交，显示一条大小约25kDa的特异杂交带，比理论预计的22.3kDa稍大，表明Ac68蛋白可能存在翻译后修饰。RT-PCR分析结果表明，ac68基因在病毒感染细胞中的转录从3 h开始就可以检测到，一直持续到感染96 h。5RACE分析发现，ac68基因的转录起始于ATG上游-18nt的杆状病毒早期启动子ACATT中的嘧呤碱基C，这些结果表明该基因为早期基因。 由于杆状病毒基因组过大，很难通过简单的酶切、连接等方法来构建重组杆状病毒，其中最经典的方法就是构建一个转移载体质粒，与杆状病毒基因组DNA一起共转染昆虫细胞，通过在昆虫细胞内二者发生同源重组，产生重组杆状病毒，再经过2-3轮的空斑纯化，获得目的重组病毒，此方法费时费力。为了研究ac68基因在病毒侵染过程中的生物学功能，本研究利用了ET-重组的方法在大肠杆菌DH10B细胞中将AcMNPV Bacmid基因组中的ac68基因片段敲除，构建了ac68基因的缺失I重组病毒，并同时在该位点插入了Zeocin基因。利用位点特异性重组技术将ac68转座入AcMNPV Bacmid的polyhedrin位点，构建了ac68基因补回型重组病毒。将经过转座带有绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,gfp)和多角体基因(polh)的野生型病毒、ac68缺失型Ⅰ病毒和ac68补回型病毒分别转染Sf-9细胞后，对细胞上清中病毒滴度的检测表明三种病毒的复制增殖没有明显差异；用所产生的子代芽生型病毒(budded virus，BV)以相同的侵染复数分别感染Sf-9细胞，病毒滴度测定分析表明三种病毒的生长曲线不存在明显差异。透射电镜观察结果表明，ac68缺失型Ⅰ病毒感染Sf-9细胞能产生与野生型病毒形态一致的芽生型病毒和包埋型病毒(occlusion-derived virus，ODV)。考虑到病毒复制不阻断或许是因为ac68缺失型Ⅰ敲除不完全的原因，我们在大肠杆菌DH10B中再次成功地实现了从AcBacmid-PG基因组中敲除ac68基因3-末端360-bp的片段，同时在该位点插入了Zeocin抗性基因，构建了带有GFP和多角体双标记的ac68基因缺失型Ⅱ的重组pAcac68KO Bacmid。将ac68基因缺失型Ⅱ的重组pAcae6sKO Bacmid转染Sf-9细胞，同时将转染后的上清溶液再次感染Sf-9细胞，荧光显微观察发现ac68基因3端360bp的缺失不会影响病毒在细胞中的复制，以上研究结果表明，ac68是AcMNPV在Sf-9细胞中增殖的非必需基因。野生型病毒和ac68缺失型Ⅰ病毒对粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)三龄幼虫的生物测定发现，同野生型病毒相比，ac68缺失型Ⅰ病毒的半致死剂量(50％ lethal dose，LD50)没有显著差异，但半致死时间却延长了16 h，说明ac68基因的缺失不影响病毒口服感染能力，但降低了杀虫速度，推测ac68基因可能与病毒在粉蚊夜蛾中的复制速度有关。 ac68对病毒晚期基因复制的影响以及对病毒在不同的宿主中增殖的作用还有待进一步的研究。