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线粒体是内源性ROS产生的重要场所，mtDNA由于缺乏组蛋白及DNA结合蛋白的保护和自身修复系统，在ROS保护酶功能低下或缺乏时，极易受到损伤而突变。为探讨ROS对耳蜗损伤的分子机制，我们应用分子生物学技术对Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗及同系野生型CD129/CD-1小鼠耳蜗mtDNA进行检测，从以下4个方面分别进行论述。 一、Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失的检测 目的 缺乏Cu/ZnSOD的保护，ROS对耳蜗mtDNA的影响，在分子水平揭示ROS对耳蜗的损害作用。方法 应用套式PCR和分子克隆测序技术对14个Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变(Cu/ZnSOD无活性，Sodl-/-)小鼠耳蜗和 7个Cu/ZnSOD杂合突变(50％Cu/ZnSOD失活，Sod1+/-)小鼠耳蜗及16个同系野生型(Cu/ZnSOD活性正常，Sodl+/+)小鼠耳蜗进行研究。结果1.Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA有三种缺失，分别为mtDNA3867bp、mtDNA3726bp、mtDNA4236bp缺失，其中Sodl-/-小鼠和Sodl+/+小鼠耳蜗 mtDNA易出现 mtDNA3867bp缺失，Sodl+/-小鼠耳蜗mtDNA易出现3726hp缺失。mtDNA4236bp缺失在三种小鼠中无或不常见。2．MtDNA缺失发生率及缺失量随着Cu/ZnSOD活性的递减而增加，Sodl-/-小鼠(分别为100%和 6.284×10~-4)明显高于Sodl+/+小鼠(分别为31.25%和0.273×10~-4)(p<0.01)。mtDNA缺失发生率在Sod1-/-小鼠和Sod1+/-小鼠(71.43%)之间及Sod1+/-小鼠和Sod1+/+小鼠之间无明显不同，mtDNA缺失量两组内小鼠比较有显著的差异(p<0.01)。结论Cu/ZnSOD对耳蜗mtDNA具有保护作用，在其功能活性低下或缺乏时，ROS可造成耳蜗mtDNA出现多处缺失突变，缺失的发生率和含量随着Cu/ZnSOD活性的增加而降低。r－—一、－J—。“、二、汕一 、—x 二 二，。工。—”趣C，W。冗W。S二FpeZ．x 二”7、＿1卜巧一／“， 川Y w．”＊b／ 博士后工作报告 中文摘要 8 nlDJon缺失突变导致编码OThHOS酶的活性异常，可能在造成听觉功能 障碍上起到了重要作用。 二、耳蜗是ROS损伤的敏感标靶一lOS损伤mtDNA的组织 特异性研究 目的探讨ROS对各种组织moNA的损伤情况，耳蜗IntDNA是否为 ROS损伤的标靶。方法应用套式 PCR及分子克隆测序技术对 10只 CLI／ZnSOD基因敲除小鼠及5只同系野生型小鼠耳蜗、脑、肝脏、肾脏、脾 脏、心脏及皮肤组织进行研究。结果1．各组织mw可检测到3种缺失， 常见的缺失为mtDN3 867hp和mo狐372柳缺失，IllUj：rvn．arx236’bp缺失不 常见。2．moNA缺失在不同组织的含量有明显的不同，肝脏和肾脏组织含 量最高，耳蜗、心脏和大脑组织其次，脾脏及皮肤组织含量最低。与野生 型小鼠比较，Cu／ZnSOD基因敲除小鼠皿o的A在不同组织的缺失量是野生 型小鼠的 3～20倍，其中耳蜗组织 mtDNA缺失量约是 WT小鼠的 15倍。结 论缺乏Cll／ZnSOD的保护，ROS可以攻击各种组织IntDN，但具有明显 的组织特异性，耳蜗IntDM是其损害的敏感标靶。 三、老龄小鼠耳蜗moNA缺失惰况 目的 探讨老龄小鼠耳蜗moNA缺失情况，明确老龄小鼠耳蜗mtDNA 缺失的位置。方法应用套式PCR和DM测序技术对不同月龄CD129C 杂交小鼠耳蜗31个（2月龄7个，7—10月龄16个，1719月龄8个）进行 定性及定量检测。结果 1．小鼠耳蜗 IntDN3867bp大片缺失，缺失发生在 fit9H～l：1112970 Z间，其两攸 m9089～l：lly103和 m12956ofl：［12970 为核昔酸 完全相同的15hp重复序列。2随着小鼠月龄的增加，耳蜗1llUJfroH6867bD 缺失发生率有明显增加的趋势，2月龄小鼠未发现缺失①厂人17叶9月龄 小鼠0侣）明显高于7～10月龄小鼠（4／16）中＜0．01人3．缺失＜tD灿总 二 ＿＿。＿＿．．、、。、。。＿＿r，。＿．、＿＿．＿、。＿、。L／＿、l、。－兰M。一．！l．Ic、尸卜。、、2呐＿／Ws。”V句为 呵。”卜”）、二＼忖“松。。。蚁／议＜嚎、耶“C5n三沪豪穹匆才么不／委二／口L大”。”～广。。’尸”。“’，。。。二－’”丫二““厂一 f人。“LU钦二人网／不虫砒琢。一 博士后工作报告 中文摘要 a IntDNA比值，17叶9月龄小鼠明显高于710月龄小鼠（＜0．01人 结论老 龄小鼠耳蜗出现 ］：I］：ln－wtyM．－－867bp大片缺失可能与老年性聋发生密切相关。 四、耳蜗铡损伤模型的确立 目的确定一?