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目的:建立并探讨聚合酶链式反应-高分辨率熔解曲线(polymerase chain reaction and high resolution melting,PCR-HRM)分析技术筛查中国汉族人群成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)患者COL1A1/COL1A2基因突变的方法。应用PCR-HRM技术筛查OI患者COL1A1/COL1A2基因突变位点,利用Sanger测序验证,并分析临床表现型与基因型的关联。方法:1.研究PCR-HRM技术的最佳反应条件,模板(DNA)浓度、PCR-HRM引物设计及引物浓度、退火温度(annealing temperature,AT)、循环数等。2.应用PCR-HRM技术结合Sanger测序对87例患者及对照者进行COL1A1/COL1A2基因筛查,有家族史的患者,也要同时进行家属的基因测序验证。对筛查结果阳性的患者进一步分析其临床表型及基因型的联系。3.在未用PCR-HRM技术筛查出异常的患者中,随机选取其中3例进行全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)分析,以确定未检测出异常的原因。结果:1.成功建立了利用PCR-HRM技术筛查COL1A1/COL1A2基因突变的方法,采用该方法筛查87例OI患者,检测出COL1A1/COL1A2基因突变44个,其中有22个新突变。COL1A1/COL1A2基因突变总检出率52.87%,COL1A1基因突变24例,COL1A2基因突变22例,两个基因突变率无显著性差异(P>0.05)。有家族史患者突变检出率高于散发病例(P<0.01)。2.COL1A1及COL1A2两基因突变方式以单碱基替换为主,以错义突变率最高(65.22%)。有30例患者由于COL1A1或COL1A2基因突变导致氨基酸替换,其中28例为Gly被替换(93.33%),以Gly被Ser替换为最多(46.43%)。COL1A2基因突变导致螺旋结构域中的甘氨酸被替换发生率高于COL1A1基因(P<0.01)。3.46例OI患者临床表型除骨折外前3位为:蓝巩膜(95.7%),四肢畸形(91.3%)及牙质形成不全(71.7%)。46例患者均无听力损伤。COL1A2基因突变患者牙质形成不全的人数、1岁之前发生骨折次数、总骨折次数高于COL1A1基因突变的患者(P<0.05)。COL1A1及COL1A2基因错义突变的患者的身高水平以中偏下为主,随着氨基酸位置的改变,这些患者的身高并未呈现特定的变化规律。4.经检测存在异常的患者中出现一例特殊病例,其同一外显子上显示有两处不同的突变,通过3种软件(PolyPhen,SIFT和Align GVGD)预测后显示两处突变均致病的可能性较大。5.在对3例患者DNA进行全基因组范围的突变扫描及相应的功能预测后,发现了两处发生在COL1A2基因上的突变,以及一处发生在候选致病基因PAPSS2上的突变,这三处突变PCR-HRM未能筛出。结论:1.首次用优化了的PCR-HRM技术筛查了汉族人群成骨不全患者COL1A1/COL1A2基因的突变,并证实PCR-HRM技术可实现COL1A1/COL1A2基因突变高效率、低成本的筛查。2.本研究筛查出22例新突变,丰富了人类胶原突变数据库。3.研究证实,PCR-HRM可以用于基因检测工作量大、外显子多、无突变热点的基因筛查。4.应用PCR-HRM技术、Sanger测序技术证实一例成骨不全双位点突变个体,经突变功能预测,突变位点分别来自其父母,两处突变的“叠加效应”导致严重表现型。5.全基因组测序是防止PCR-HRM漏检的有效方法。