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沙葱萤叶甲Galeruca daurica(Joannis)是近年来在内蒙古荒漠草原猖獗成灾的一种新害虫。沙葱萤叶甲幼虫最早于4月上旬开始发生,此时发生地气温低、波动大,最低温度可达-10℃。本实验室前期研究表明,沙葱萤叶甲幼虫具有较强的抗寒能力,但对其抗寒性的机理目前了解得很少。本研究采用高通量测序技术,以沙葱萤叶甲2龄幼虫为研究对象,进行了转录组测序。对得到的测序数据进行初步的处理后,再通过数据组装、注释和生物信息学(GO分类、COG注释、Nr注释、代谢通路分析等)分析方法,对其转录组进行了分析;对不同温度处理的幼虫转录组间进行差异表达分析,筛选出与温度胁迫相关的关键基因和代谢通路;同时,对筛选出与冷胁迫相关的2个关键基因进行了克隆、生物信息学及表达谱分析。主要结果如下:1.沙葱萤叶甲2龄幼虫分别经-10、-5、0、5、25(对照)和35℃处理1 h、25℃恢复30 min后,进行转录组测序,组装获得6个转录组,经测序质量控制,共得到32.67Gb clean data,6个样品Q30碱基百分比均高于85.75%。共得到30,915,046条reads片段和22,732,768个contigs,进一步组装成142,994条transcripts和72,352条unigenes,平均长度分别为1110 bp和793 bp,transcript与unigene的N50分别为2,109和1,527,组装完整性较高,其中有31,513个unigenes得到了功能注释。选取11个差异表达基因,进行了RT-q PCR验证,其中9个差异基因RT-q PCR与转录组的结果一致。2.与25℃对照相比,5个温度胁迫处理(-10、-5、0、5和35℃)样品,分别有718、865、1142、1474和1063个差异表达基因获得功能注释,冷胁迫(-10、-5、0和5℃)共同差异表达基因268个,高、低温胁迫共同差异表达基因38个,主要为一般功能预测基因和次生代谢产物、无机离子、碳水化合物、氨基酸转运和代谢相关基因。GO富集分析表明,表达差异基因多集中于生物学过程中的代谢过程和分子功能中的催化活性,这说明温度对沙葱萤叶甲幼虫的代谢和催化活性会造成较大影响,KEGG富集分析结果也表明差异表达基因显著富集于代谢通路中的丙酮酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及嘌呤代谢。3.采用RACE技术,克隆获得了1条沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因,并命名为Gd SP(Gen Bank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 k D,等电点5.61;编码蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶特征,具1个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd SP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。RT-q PCR测定结果表明,快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。4.采用RACE技术,克隆获得了1条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因,并命名为Gd Abd(Gen Bank登录号:MG874710),该基因全长708 bp,开放阅读框477 bp,编码158个氨基酸;蛋白预测分子量16.98 k D,等电点4.26;编码蛋白具有表皮蛋白R&R保守结构域的典型特征,属于RR-2亚族;具有1个跨膜结构和1个信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Abd与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Sg Abd-4的同源性最高,氨基酸序列一致性为50.63%。RT-q PCR检测结果表明,短时低温胁迫不能显著影响Gd Abd的表达,但胁迫后回温可诱导其上调表达。