产脂肪酶菌株的筛选及在催化拆分异丙甲草胺中间体中的应用

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脂肪酶是继蛋白酶和淀粉酶之后的第三大工业用酶,应用前景巨大,且其具有来源广泛、筛选方法成熟、催化效率高、催化反应多样(酯水解、酯交换、酯合成等)等优点。本文旨在筛选高产脂肪酶的菌株,并能够高效、选择性拆分异丙甲草胺中间体。从土壤中筛选出15株能够催化拆分异丙甲草胺中间体的具有立体选择性的菌株,其中水解R-异丙甲草胺中间体的菌株所对应产物对映体过量值(eep)大于95%有一株,通过生理生化和16SrRNA鉴定,初步认为该菌种属于Pseudomonas属,并命名为styj。为了获得较高的脂肪酶活力,在摇瓶培养下,利用单因素和正交试验,对培养基及其培养条件进行优化。优化后:葡萄糖10 g/L、酵母粉20 g/L、MgSO4 0.5 g/L、ZnCl2 0.5 g/L、橄榄油10 g/L、初始pH7.5、培养温度37℃、发酵时间48h,此时酶活最高,为5.61 U/mL,与优化前比相对酶活提高到308.98%。菌体破碎后的粗酶液经70%硫酸铵沉淀、透析、超滤浓缩、阴离子交换层析、凝胶过滤层析,经SDS-PAGE检测,分子量约为35 kDa。通过对全细胞催化异丙甲草胺中间体的实验研究,得出最适条件:以0.2mol/L、pH 7.0磷酸缓冲液作为催化溶剂,该酶在37℃左右时酶活最高,在20℃下,酶稳定性好,50℃时酶活力急剧下降。该酶最适pH在7.0,在5.0-9.0之间稳定,pH低于5.0时酶活力急剧下降。同时发现除K+对脂肪酶活性有促进作用外,实验中采用的大多数金属离子和表面活性剂对酶活力都有抑制作用。另外,二甲基亚砜、乙腈、丙酮、乙醚、二异丙醚、环己烷、正己烷等不同极性(Log P)有机试剂对酶活都有抑制作用。
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