【摘 要】
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肝炎,肝硬化,肝癌为肝脏疾病三部曲。肝炎主要是甲型、乙型、丙型等肝炎病毒所引起。肝炎易引起肝脏病变,肝硬化的发生通常是由于肝脏长期反复损害所导致,如果不积极防治,易引起其他并发症,甚至最终发展为肝癌。手术肝切除治疗是治愈肝癌最有效的方法。肝脏切除对机体有严重的损伤通常伴随缺血再灌注,缺血再灌注损伤也是影响患者恢复的关键因素之一。缓解肝脏切除后的肝细胞凋亡过程有望作为一种治疗策略。对其分子机制的深入
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肝炎,肝硬化,肝癌为肝脏疾病三部曲。肝炎主要是甲型、乙型、丙型等肝炎病毒所引起。肝炎易引起肝脏病变,肝硬化的发生通常是由于肝脏长期反复损害所导致,如果不积极防治,易引起其他并发症,甚至最终发展为肝癌。手术肝切除治疗是治愈肝癌最有效的方法。肝脏切除对机体有严重的损伤通常伴随缺血再灌注,缺血再灌注损伤也是影响患者恢复的关键因素之一。缓解肝脏切除后的肝细胞凋亡过程有望作为一种治疗策略。对其分子机制的深入研究有望发现新的治疗靶点,有助于肝脏切除患者术后恢复。Mfn2（Mitofusin 2,线粒体融合蛋白2）是线粒体融合蛋白成员,对线粒体融合至关重要。Mfn2不仅介导线粒体融合,也与内质网应激,自噬,能量代谢,细胞凋亡密切相关。研究表明在心脑缺血再灌注后,Mfn2表达水平降低。脑缺血再灌注后,脑皮质存活神经元基因计数下降,神经元凋亡率上升,Mfn2表达降低。在70%小鼠肝切除后,鼠肝中Mfn2表达水平降低。但缺血再灌注联合肝脏大部切除后Mfn2水平变化尚无报道。我们前期采用芯片分析发现缺血再灌注联合85%肝切除（IR+PHx85%）后,鼠肝中Mfn2表达水平降低。miRNA是长20个左右核苷酸的内源性非编码小RNA。研究发现成纤维细胞中过表达miR-346-3p,细胞活力降低。肝脏切除后miR-346-3p的水平变化尚无研究。我们前期采用芯片分析发现在缺血再灌注联合85%肝切除后,鼠肝中miR-346-3p表达水平上升,同时miR-346-3p可潜在靶向Mfn2的3′UTR。本文采用缺血再灌注联合85%肝切除模型,在鼠肝脏大部切除的同时进行缺血再灌注处理,贴合临床肝切除,有益于肝衰竭及中晚期肝癌患者治疗。本论文旨在探究miR-346-3p是否靶向Mfn2调控线粒体凋亡通路从而负调节肝再生。目的:1.检测组织样本中miR-346-3p和Mfn2及凋亡分子的表达水平以及肝脏特异性敲除Mfn2后凋亡分子的表达水平。2.明确miR-346-3p与Mfn2靶向结合关系。3.探究miR-346-3p和Mfn2对AML12细胞ROS,ATP,线粒体膜电位的影响。4.确定miR-346-3p和Mfn2对AML12细胞凋亡的影响。方法:1.q RT-PCR（实时荧光定量PCR）及WB（免疫印迹）法检测组织样本中miR-346-3p和Mfn2及凋亡分子的表达水平。2.荧光素酶基因报告实验验证miR-346-3p与Mfn2是否靶向结合。3.化学荧光法检测miR-346-3p和Mfn2对AML12细胞ROS生成的影响。4.化学发光法检测miR-346-3p和Mfn2对AML12细胞ATP生成的影响。5.流式细胞术检测miR-346-3p和Mfn2对AML12细胞线粒体膜电位的影响。6.q RT-PCR法检测miR-346-3p对Mfn2表达的影响。7.WB法检测miR-346-3p对Mfn2和凋亡分子以及Mfn2对凋亡分子的影响。结果:1.对照Sham组,在IR+PHx85%12h（缺血再灌注联合85%肝切除12 h）组样本中miR-346-3p表达上升,Mfn2表达降低。2.对照Sham组,在IR+PHx85%12h组样本中Bcl2表达降低,Bax、Cytc、cleaved Parp表达上升。肝脏特异性敲除Mfn2后,肝中Bcl2表达降低,Bax、Cytc、cleaved Parp表达上升。对照肝脏特异性敲除Mfn2组在肝脏特异性敲除Mfn2联合IR+PHx85%12h组凋亡分子水平无差异。3.miR-346-3p靶向Mfn2-3′UTR。4.miR-346-3p过表达或Mfn2敲降增加AML12细胞ROS生成,减少ATP生成,降低线粒体膜电位。5.miR-346-3p抑制Mfn2表达。6.miR-346-3p表达促进AML12细胞凋亡,Mfn2表达抑制AML12细胞凋亡。结论:1.在IR+PHx85%12h后,鼠肝中miR-346-3p、Bax、Cytc、cleaved Parp高表达,Mfn2、Bcl2低表达。肝脏特异性敲除Mfn2后鼠肝中Bcl2低表达,Bax、Cytc、cleaved Parp高表达。2.miR-346-3p靶向Mfn2-3′UTR。3.miR-346-3p表达增加AML12细胞ROS生成,减少ATP生成,降低线粒体膜电位。Mfn2表达减少AML12细胞ROS生成,增加ATP生成,升高线粒体膜电位。4.miR-346-3p表达促进AML12细胞凋亡,Mfn2表达抑制AML12细胞凋亡。
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