背景：人类认知功能随着衰老而逐渐下降。脑是性激素的重要靶器官。性激素不仅影响脑生殖相关区域(如下丘脑、垂体)的功能,而且对认知功能也有调节作用。绝经期女性由于卵巢功能衰退,雌、孕激素水平降低,认知功能显著下降。研究显示,围绝经期妇女轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment, MCI)和阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease, AD)的发病率显著升高；绝经后,62%-70%的妇女会出现认知能力的下降。此外,过早绝经,特别是手术绝经(低于45岁)可以增加认知能力下降及痴呆的发生风险；绝经年龄越低,其风险值越高。因此,“国际绝经协会(International menopausal society, IMS)关于绝经后激素治疗的最新建议”推荐过早绝经的女性应该接受激素替代治疗(Hormone replacement therapy, HRT)直至自然绝经年龄。认知功能下降不仅与自然衰老有关,也与性激素的缺失密切相关。激素替代治疗(HRT)有望成为预防和治疗绝经期认知功能下降的有效手段。HRT应用于临床的几十年中,其发展经历了极其曲折的过程,也取得了一些成绩。目前,HRT被认为是缓解绝经相关症状(如血管舒缩症状、泌尿生殖道萎缩、骨质丢失等)最有效的方法。但是,HRT对认知功能下降,如轻度认知功能障碍、阿尔兹海默病等的影响还有待进一步研究。随着人口老龄化,我国绝经期妇女人数已经超过1亿。有关HRT对大脑认知功能调节的研究具有重要意义。HRT孕激素种类及治疗时机的选择可能影响其对认知功能的调节作用。2003年,WHI (Women’s Health Initiative,美国妇女健康倡议)公布的数据显示,结合雌激素联合醋酸甲羟孕酮不但不能预防绝经后退行性认知功能减退,反而会增加AD的发病风险。这与既往观念大相径庭,引起了医疗界的广泛关注。对有完整子宫的绝经后妇女,HRT中孕激素的添加是必需的,可以预防子宫内膜癌的发生。大量研究表明,雌激素(Estrogen, E2)可以改善绝经后认知功能下降；但是孕激素对大脑认知功能的调节作用目前尚没有确切结论。对WHI研究结果进行分析后认为,醋酸甲羟孕酮(MPA)的使用与其负性实验结果有关。不同的孕激素对大脑认知功能的调节作用不同。动物实验表明,MPA单独或联合雌激素使用可以损害去卵巢(Ovariectomy, OVX)动物大脑认知功能。WHI研究中其研究对象的年龄较大(平均63.3岁),错过了激素替代治疗的最佳时机。进一步的研究阐明孕激素种类及治疗时机对HRT调节认知功能作用的影响,将对临床HRT应用具有重要的指导意义。地屈孕酮(Dydrogesterone, DG)是第三代合成孕激素。其分子结构与天然孕激素非常接近,能与孕激素受体(Progesterone receptor, PR)特异性结合。与天然孕酮相比,地屈孕酮的口服生物利用度高,临床应用更方便；与MPA相比,DG不与雌激素受体(ER),雄激素受体(AR)及糖皮质激素受体(GR)结合,副作用小。临床研究表明,地屈孕酮对绝经后女性子宫内膜有保护作用,对其他组织器官(如心血管,乳腺组织等)不良影响较小,有很大的应用潜力。动物实验也显示,地屈孕酮对使用雌激素的OVX大鼠的子宫有保护作用,并且可以提高大鼠脑内四氢孕酮(Allopregnanolone,具有神经活性的孕激素代谢产物)的含量。但是,目前尚无地屈孕酮对绝经后认知功能的影响的研究。建立合适的绝经动物模型,对了解绝经期认知功能下降的发生、预防和治疗有重要的意义。本研究通过了解雌性SD大鼠在不同月龄的卵巢功能状态和基础认知水平,选取合适鼠龄的大鼠建立绝经模型。采用动物行为学测试的方法,观察地屈孕酮对不同鼠龄大鼠绝经模型认知功能的影响；并通过观察治疗后子宫重量及乳腺结构的变化,评估地屈孕酮对大鼠子宫及乳腺的影响；运用分子生物学实验方法,初步探讨了地屈孕酮发挥认知调节作用的可能机制。为激素替代治疗(HRT)在改善绝经期认知功能中的应用提供有价值的实验室依据。第一部分大鼠绝经模型的建立采用去卵巢(OVX)的方式建立大鼠绝经模型。大量临床及基础数据显示,HRT治疗存在治疗时间窗(Window of opportunity),即在特定时间给药治疗效果最佳；本研究通过系统地评估不同月龄雌性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)的卵巢功能状态和基础认知水平,选取处于不同衰老时期的大鼠建立绝经模型,模拟人类绝经期前后不同阶段的内分泌状态,以进一步研究地屈孕酮在HRT治疗中对大脑认知功能的影响及其机制。1.不同月龄SD大鼠卵巢功能和认知水平评估目的：采用阴道细胞涂片(Vaginal smear)的方法观察雌性SD大鼠在不同鼠龄的卵巢功能状态；通过动物行为学测试了解雌性SD大鼠在不同鼠龄的基础认知水平。为大鼠绝经模型的建立选取合适鼠龄的大鼠。实验方法：通过阴道细胞涂片将发情周期规律的成年雌性SD大鼠分为如下四组：P组(Proestrus,发情前期)、E组(Estrus,发情期)、M组(Mestrus,发情后期)和D组(Diestrus,发情间期),每组8只。采用Morris水迷宫(1-day)和旷场实验的方法检测规律发情周期内不同时相雌性大鼠的认知行为。选取3月龄、7月龄、12月龄、18月龄、24月龄健康雌性SD大鼠,每组8只。通过阴道细胞涂片的方法,观察不同鼠龄大鼠的发情周期,评价其卵巢功能状态。采用经典Morris水迷宫及旷场实验方法测试各月龄组大鼠认知能力水平。结果：1.健康成年大鼠发情周期不同时相的认知行为表现没有显著性差异。Morris水迷宫(1-day)结果显示,处于不同周期时相的各组大鼠逃避潜伏期及游泳速度无统计学差异；目标象限时间百分比及穿越平台次数也无统计学差异。旷场实验指标在各组大鼠之间均没有显著差异。发情周期内性激素水平的波动对成年大鼠的认知行为没有显著影响。2.大鼠发情周期随月龄增加发生变化。3月龄、7月龄大鼠发情周期规律,周期长4-6天；每个周期分四个阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。12月龄大鼠虽然发情周期依然存在,但周期长短无规律；18月龄大鼠发情周期紊乱,处于持续发情间期或假孕状态；24月龄大鼠周期消失。提示随着大鼠月龄增加,卵巢功能逐渐减退。3.大鼠的认知行为(空间学习及记忆)受鼠龄影响。3月龄和7月龄组大鼠之间认知行为没有显著差异。大鼠在12月龄时出现Morris水迷宫逃避潜伏期的显著延长,目标象限时间缩短；旷场实验中跨格次数及站立次数减少。18月龄、24月龄大鼠认知行为表现进一步减退。2.大鼠绝经期模型的建立与评估目的：通过去卵巢手术(OVX)建立大鼠绝经模型,并评估模型建立成功与否。实验方法：采用去卵巢手术(Ovariectomy, OVX)方式建立绝经模型。选取7月龄、18月龄健康雌性SD大鼠,分别分为三组：空白对照组(C组)、假手术组(S组)和去卵巢组(OVX组),每组8只。C组大鼠做空白对照组；OVX组大鼠行卵巢切除术,而S组大鼠仅切除卵巢周围脂肪组织。术中严密观察大鼠生命体征。术后行阴道细胞学涂片观察发情周期的变化。术后1个月,采用经典Morris水迷宫和旷场实验,观察大鼠术后认知行为的改变。行为学测试结束后,处死大鼠。观察各组大鼠子宫形态改变并称重。结果1.OVX术后大鼠发情周期消失。OVX术后大鼠阴道细胞涂片逐渐以白细胞为主并持续5天以上,说明大鼠发情周期消失,卵巢功能缺失。结果显示,术后15天左右两个月龄组OVX大鼠发情周期消失。2.术后1个月,OVX组大鼠认知功能下降。7月龄大鼠空间学习能力损害明显,逃避潜伏期显著延长(P<0.001)；目标象限时间和穿越平台次数减少(P<0.01)。18月龄组大鼠认知能力也下降,但与对照组相比,没有统计学意义。旷场实验中,18月龄大鼠自发活动能力较7月龄组下降,跨格次数及直立次数减少。去卵巢手术后,中年大鼠站立次数显著减少(P<0.05),探索行为减弱。3.术后1个月,OVX组大鼠子宫形态和重量发生变化。与对照组相比,OVX组大鼠子宫体积明显缩小,呈细线状,颜色苍白；子宫重量显著降低(P<0.01)。假手术组与空白对照组之间没有显著性差异。结论：1.选取即将出现卵巢功能减退及卵巢功能由紊乱至衰竭两个时期的大鼠,即7月龄和18月龄大鼠,用于绝经模型的建立,模拟人类围绝经期前后不同阶段的内分泌状态。2.OVX术后大鼠发情周期消失,子宫重量减轻；行为学测试显示两个月龄组大鼠在卵巢切除后均出现了认知行为的改变,以7月龄组大鼠对手术影响更敏感。绝经模型成功建立。第二部分地屈孕酮对大鼠绝经模型认知行为的影响及机制研究研究目的：研究地屈孕酮(Dydrogestrone, DG)对大鼠绝经模型认知功能的影响及其机制；并通过观察治疗后大鼠子宫重量及乳腺组织结构的变化,评估DG用于激素替代治疗(HRT)的安全性；初步探讨DG给药时机对OVX大鼠认知行为的影响。研究方法：将各月龄组大鼠分别分为5组：对照组(Sham组),模型组(OVX组),雌激素治疗组(OVX+E2组),雌激素联合地屈孕酮治疗组(OVX+E2/DG组)和地屈孕酮治疗组(OVX+DG组)；每组8只。Sham组和OVX组服用安慰剂,其余3组分别经口服给予相应激素替代治疗：雌激素(17β-estrogen, E2)、雌激素联合地屈孕酮(E2/DG)、地屈孕酮(dydrogesterone, DG)。用药20周后,采用Morris水迷宫和旷场实验的方法检测各组大鼠认知行为的差异。用于评价不同激素治疗方案对大鼠认知功能的影响。行为学测试结束后,将大鼠处死。动物处死后,取大鼠第四对乳腺；乳腺组织经福尔马林固定后,包埋成蜡块；完整取出大鼠位于腹腔内的Y型子宫。乳腺HE染色观察用药后各组大鼠乳腺形态学改变。称量子宫重量,用子宫重量(mg)／体重(g)比值评价激素替代对OVX大鼠子宫的影响。部分大鼠经断头取脑,迅速分离大鼠海马组织并冻存备用。其余大鼠灌注取脑,将完整取出的脑组织置福尔马林溶液中后固定,包埋成蜡块,切片备用。采用实时定量PCR和ELISA的方法,检测冻存海马组织中促炎因子IL-1β和TNF-α表达情况；免疫组织化学染色的方法检测海马组织中NeuN、Iba-1及Aβ1-42表达情况；Tunel检测海马组织内细胞凋亡情况。结果：1.地屈孕酮单独用药对OVX大鼠认知行为没有显著的影响。OVX大鼠与Sham组大鼠相比,逃避潜伏期显著延长(P<0.01),目标象限时间百分比减少(P<0.01),即去卵巢术后大鼠空间认知能力受损。OVX+DG组大鼠与OVX组大鼠相比没有表现出差异(P=0.132)。单独使用DG可以减少旷场实验中央格停留时间(P<0.05),但对跨格次数和直立次数没有影响。提示地屈孕酮单独用药不能改善OVX大鼠的空间认知能力。2.雌孕激素联合给药后对OVX大鼠认知能力的影响。7月龄组,OVX+E2组大鼠和OVX+E2/DG组大鼠找到平台所需的时间均比OVX组大鼠显著缩短(P<0.001)；目标象限时间百分和穿越平台次数较OVX组大鼠显著增多(P<0.001,P<0.05)。旷场实验中,E2和E2/DG均可以增加中央格停留时间(P<0.05)。18月龄组,OVX+E2组大鼠与OVX+E2/DG组大鼠仅空间探索实验中目标象限停留时间比OVX大鼠增多。结果提示,地屈孕酮联合雌激素治疗可以改善OVX大鼠的空间认知能力,减轻大鼠焦虑情绪；7月龄组大鼠对治疗的反应优于18月龄组大鼠；3.地屈孕酮对OVX组大鼠子宫形态和重量的影响。去卵巢术后,大鼠子宫重量显著减轻；地屈孕酮与雌激素联合应用时,地屈孕酮可以拮抗雌激素的子宫增重作用；地屈孕酮单独使用时,对OVX大鼠子宫重量无明显影响。4.地屈孕酮对OVX大鼠乳腺组织形态学的影响。去卵巢导致大鼠乳腺腺体萎缩；雌激素可以显著减轻乳腺组织萎缩,促进乳腺小叶及导管发育。OVX+E2/DG组与OVX+E2组大鼠有相同的乳腺组织学表现；地屈孕酮单独使用时,乳腺腺体结构与OVX大鼠相似。18月龄对照组大鼠乳腺腺体增生明显,部分自发乳腺肿瘤。地屈孕酮不增加乳腺增生的发生风险。5.各组大鼠海马炎症因子表达水平的差异。结果显示,18月龄大鼠海马组织IL-1β和TNFa表达水平比7月龄大鼠高。OVX术后,炎症因子IL-1β和TNFa的表达水平均增加,但是18月龄组大鼠增加更明显。OVX+E2/DG组大鼠炎症因子水平较OVX组低,而OVX+DG组大鼠的炎症因子水平明显高于除OVX组之外的其他各组大鼠。6.各组大鼠海马小胶质细胞表达情况。Iba-1免疫组化结果显示,小胶质细胞在18月龄对照组大鼠海马中的数目比7月龄对照组大鼠明显增多,活化比例上升。OVX引起7月龄大鼠小胶质细胞数目增多；OVX+E2/DG组大鼠小胶质细胞数目比OVX组减少。18月龄大鼠各组之间差异不显著。7.各组大鼠海马组织中Aβ1-42表达变化。Aβ1-42在18月龄对照大鼠海马中的表达水平高于7月龄对照大鼠。OVX术后,7月龄大鼠海马Aβ1-42水平显著增高,老龄大鼠A β1-42水平有所升高,但没有统计学意义。7月龄大鼠OVX+E2组和OVX+E2/DG组A β1-42水平较OVX组显著下降,OVX+DG组Aβ1-42水平下降不显著。8.各组大鼠海马神经元数目及凋亡情况变化。去卵巢手术后,7月龄组大鼠海马神经元数目显著减少,18月龄组细胞数目变化不明显。海马CA3区神经元受去卵巢影响较显著,特别是7月龄组大鼠。OVX+E2和OVX+E2/DG组大鼠神经元数目较OVX组上升；OVX+DG组神经元数目较OVX组略多。细胞凋亡在老龄组较明显,且以CA3区最为显著。结论：1.地屈孕酮(DG)单独替代不能改善OVX大鼠的认知行为；2.E2/DG治疗可以改善OVX大鼠认知行为,发挥子宫保护作用的同时不增加乳腺增生的风险；3.HRT对认知功能的调节作用与OVX大鼠的鼠龄有关；7月龄组大鼠E2及E2/DG的治疗效果比18月龄组大鼠好。E2/DG对治疗绝经期认知功能下降有潜在的临床应用价值,特别对提早绝经者更有必要；4.E2/DG治疗可以有效缓解去卵巢引起的大鼠海马炎症反应及细胞凋亡；5.去卵巢引起的海马炎症反应增强,可能与OVX术后认知功能障碍有关；地屈孕酮对认知功能发挥作用与其对海马炎症反应的调节有关。